细胞融合与单克隆抗体-2.pptVIP

细胞融合与单克隆抗体;3.2 单克隆抗体技术 3.2.1 杂交瘤单克隆抗体技术的理论 3.2.2 杂交瘤技术过程 3.2.3 单克隆抗体的规模化生产 3.2.4 单克隆抗体的改造和应用 ;免疫系统;T细胞和B细胞的分化;T细胞介导的免疫应答;一、抗原的识别与递呈（感应阶段）;抗原呈递细胞(antigen-presenting cell );巨噬细胞起抗原呈递细胞（APC）作用，并分泌 IL－1。TH 分泌 IL－2，分别作用于 Tc－细胞和 B－细胞。;T细胞活化的第一信号;T细胞活化的第二信号;T细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进一步促进T细胞活化、增殖。 若TCR特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信号，则T细胞被诱导呈不应答。 ;（三）T细胞的增殖和分化;Tc杀伤细胞;细胞免疫应答;体液免疫应答;抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统， 诱导发生免疫应答，产生体液免疫的 抗体和（或）细胞免疫的效应淋巴细 胞，并在体内外与之反应的物质。 ;能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性： ;抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，B淋 巴细胞产生的一类糖蛋白,能与相 应抗原特异的结合，产生各种免疫 效应（生理效应）的球蛋白。;抗体 (Ig) : （Immunoglobulin) 抗体分类： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE; ; 每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，而由这一个细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体;3.2.1单克隆抗体技术的基本理论;Georges J. F. Kohler ;单克隆抗体(monoclonal antibody);单克隆抗体生产技术(杂交瘤技术);3.2.1.1杂交瘤技术的基本原理; 高度均一性： 纯度很高的均一性抗体 高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代 ;3.2.1.3 亲本细胞的选择; B淋巴细胞： 1.经特定抗原免疫能产生目的抗体的动 物淋巴细胞 2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致 或有相近亲源关系 ;3.2.1.3 融合细胞的选择原理;原理：;细胞内DNA的生物合成途径;3.2.2 杂交瘤技术过程;动物免疫 ;一、免疫动物;常规免疫法 脾内一次性免疫法 短程免疫法 体外免疫法 ;;常规免疫法：;二.融合细胞的制备 ;骨髓瘤细胞的制备;三.两种细胞杂交融合;四.分装培养;融合后细胞在HAT培养基中存活情况 脾细胞（ HGPRT+, TK+, 不能长期生长） 骨髓瘤细胞（ HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（ HGPRT+, TK+ ，能够生长）; 筛选： 免疫荧光 ELISA等 ;克隆化： 有限稀释法 软琼脂培养法;抗体检测;酶联免疫吸附法(ELISA);单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法 离子交换层析 A蛋白-Sepharose亲和层析 ;单克隆抗体的生产 体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的 腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等 ;3.2.3单克隆抗体的规模化生产; 现在的生物技术公司一般采用生物反应器悬浮培养的方法生产单克隆抗体。由于杂交瘤细胞的高密度生长，使得抗体效价可达到10~100mg/ml。 美国Damon公司的专利方法是将细胞培养在一种中空的微球体内，这种被称之为微囊的微球体外面由多孔膜包裹，使内部生长的杂交瘤细胞受到多层保护而不受环境影响???此种微囊技术生产的抗体可达0.1-1g/L。抗体的生产达到一定的规模。;影响因素分析;（三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A 抵抗细胞所致 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好 细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆 竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的 生长；也可能发生染色体丢失。