(二)离子交换剂的选择.ppt

第三章：层析技术; 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产， 还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。 ;层析技术的分类 (1) 按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。 (2) 按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。 (3) 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章按第三种分类进行叙述。 ;第一节 吸附层析 ; 凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的，而固体表面的分子所受的力是不对称的。 向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外的一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。本节主要介绍吸附柱层析和聚酰胺薄膜层析 ，薄层吸附层析将在本章第六节介绍，气固吸附层析在第七节介绍。;一、吸附柱层析 ;; 在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。 如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。 ;(一) 吸附剂的选择 ;羟基磷灰石 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2，简称HA]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。 ;使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按1∶6体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用； (4) 就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。 用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速。 ;2. 硅胶 是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110℃加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500℃，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸