实验2植物基因组DNA的提取笔记.docVIP

实验二 植物基因组DNA的提取 Tris 读音 “吹斯” 脱氧核糖核酸酶DNase 是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂， 造成DNA降解。苯酚使蛋白变性，离心时沉淀下来，而DNA溶解在溶液中。 在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物.酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质，需要在研磨时加??抗氧化的PVP，用PVP是利用它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后,通过离心除去。另外，在加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质被氧化，主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化。 巯基乙醇加入的目的是提供一种还原剂，这样酚类物质就不能被氧化成醌，从而影响你提DNA的实验。巯基乙醇兼有这两方面功能，消泡和保护DNA。特别是样品中酚类物质较多的时候，可以适当增加巯基乙醇的量，DNA提取的成功率更高。巯基乙醇有消泡的作用。不然你加了CTAB在震荡过程中会出现大量气泡，影响后续操作。不是用来防止DNA氧化的。 PVP粉才是用来防止氧化的。还原剂，防止酚的氧化。很重要。如果不加提出的核酸会呈现灰黑色。 异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。 我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。 RNase是一种核糖核酸内切酶，即RNA（水解酶）它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。 λDNA/HindⅢ Marker是由λDNA经Hind Ⅲ完全酶切并经灭活处理而成，共有8条DNA片段，已加入上样缓冲液，可直接电泳，每次上样5μl，浓度为0.1μg/μl。bp)：125、564、2027、2322、4361、6557、9416、23130储存：-20℃可保存一年以上，4℃可保存2-3个月。 目录号 包装 价格 MD202-50 50T 90.00 MD202-100 100T 150.00 Tris饱和酚 瓶/250ml PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：加入PVP的目的是使PVP吸附酚类物质，这样就可减轻酚类物质对你所提DNA的影响。PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。PVP为一种水溶性高分子聚合物,化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，是一种有机物。个人认为不适合提前加入和CTAB提取液一起高压灭菌。我们实验室是灭菌后加PVP和巯基乙醇,每次用前65度水浴。加CTAB时应在通风橱中进行。聚乙烯吡咯烷酮 PVP-40 Sigma-Vetec原装 V900008-100g 。 “植物材料中,特别是老的或是经逆境处理的材料,含有大量的酚类化合物,这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合,使DNA带棕色或褐色,并能抑制DNA的酶解反应.为防止这类情况出现,可以向提取缓冲液中加入2%(W/V)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或增加抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度”，“在植物总DNA提取过程中加入PVP ，可以防止植物细胞中的多酚类物质氧化” DNA的存在形式分两个方面： 如果在体外（如提取出来的），存在状态多样，可以是链状（动植物基因组DNA），可以是环状（质粒DNA），可以是单独存在也可以结合其他物质存在，可以单链存在也可以双链存在，可以有序存在也可以杂乱存在，等等啦。 如果是在体内，真核生物。原核