第二章电镜酶细胞化学技术与电镜免疫细胞化学技术.pptVIP

第二章;概述 电镜细胞化学技术;电镜细胞化学技术主要包括：;第一节 电镜酶细胞化学技术;★ 电镜酶细胞化学与光镜酶组织化学的比较： 光镜酶组织化学 电镜酶细胞化学 分辨率低 分辨率高 难于鉴别细胞器和酶的精确位置 易于鉴别和定位 反应产物为有色沉淀 反应产物必需有高电子密度 可显示100多种酶 可显示40余种酶;★电镜酶细胞化学的基本原理;常用捕捉剂有：重金属（铅、钡、铜）盐、重氮盐、二氨基联苯胺等。;★ 电镜酶细胞化学反应的主要方法;② 酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被氧化，底物之二为捕捉底物，在反应中被还原，被还原的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀。; 琥珀酸脱氢酶 琥珀酸盐 铁氰化物 延胡索酸盐 亚铁氰化物 Cu2+ 亚铁氰化铜（高电子密度） ;（2）非金属有机化合物沉淀法;（3）锇化法;★电镜酶细胞化学的常规操作流程; 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单独使用其中一种作为固定液。 ;选择固定剂 原则上优先考虑保存酶活性，一般采用醛类固定剂。甲醛对酶活性的保存优于戊二醛，但对细胞超微结构的保存略差。戊二醛对细胞的超微结构的保存优于甲醛，为发挥二者的长处，可采用甲醛戊二醛混合固定液。 ;固定的温度与时间 固定液的使用温度一般是0-4℃。固定时间视目标酶对固定剂的敏感程度而定缓冲液;2、切片：一般采用组织切片机进行切片，厚度在40～60μm，也可以用冰冻切片机切片。 3、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟。; 4、孵育：孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵育，孵育温度一般为37℃。孵育时间因器官和酶的种类不同而有很大差异(具体时间见各种酶的孵育液的配方及孵育方法)。;孵育液的组成 浓度充分的酶作用底物、捕捉剂、酶激活剂，对照试验应再加抑制剂。 孵育液配制的要求 所用器皿应十分清洁； 用前新配制； 按处方顺序依次加入试剂； 调整PH至酶作用的最适值。 ;5、漂洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液要保持在4℃左右。 6、后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。;7、脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。 8、电镜观察：超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好，可以进行铅—铀双重染色，但必须有不染色的切片对照。;须注意 固定切记“兼顾、协调”原则，过强的固定造成酶的活性损失，固定太弱又造成细胞结构保存不良。 ①因锇酸能使大多数酶活性丧失，故禁忌在酶细胞化学反应前使用； ②通常用0.5-2%戊二醛或4%多聚甲醛4℃固定2小时左右（但葡萄糖-6-磷酸酶、琥珀酸脱氢酶只能固定几分钟）。也可用多聚甲醛--戌二醛固定。 ③可通过改变固定的时间、温度、固定剂的种类和浓度调整固定的效果。 ; 第二节 电镜免疫细胞化学技术;细菌，冰冻超薄切片，免疫标记腺苷酸环化酶，醋酸铀染色; 电镜免疫细胞化学：简称免疫电镜，是利用抗原抗体特异结合的原理，在组织细胞原位显示抗原或抗体大分子的方法。;标记抗体;标记抗体的方法： 1、酶标记法，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 葡萄糖氧化酶等。 2、铁蛋白标记法 3、重金属标记法，如胶体金 4、同位素标记法 5、荧光标记法 ; 根据标记方法的不同， 电镜免疫细胞化学技术分为免疫酶标技术、免疫胶体金技术和免疫铁蛋白技术。;★过氧化物酶标记电镜免疫细胞化学技术;用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物