酵母菌计数的.doc

微生物的大小测定及显微镜直接计数 一、实验目的 1、学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。 2、了解血细胞计数板的构造及计数原理。 3、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、实验原理 1、微生物大小测定原理 微生物细胞的大小是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。其测量工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻标准刻尺的载玻片，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100小格，每一小格长度为0.01mm，即10μm。如图1。 图1 镜台测微尺中央部分及镜台测微尺校正目镜测微尺 目镜测微尺，如图2，是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。 图2 目镜测微尺 2、测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。本次试验采用显微直接计数法。 显微直接计数法：将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。显微计数法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。无论哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。 使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则： 1mL菌液中的总菌数=  eq \f(A,5) ×25×104×B=5×104×A·B （25个中格） 血球计数板 计数区 三、实验器材 1、菌种 酿酒酵母菌 2、溶液与试剂 0.1%吕氏碱性美蓝染液，二甲苯溶液，香柏油，蒸馏水。 3、仪器及其他用品 目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸；血球计 数板、移液管；锥形瓶，载玻片，滴管等 四、操作步骤 ㈠微生物大小的测定。 （1）安装目镜测微尺 取出目镜，把目镜上的透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。 （2）校正目镜测微尺 将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数（图一）。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。 由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。 目镜测微尺每格长度（μm）=  eq \f(两重合线间镜台测微尺格数×10,两重合线间目镜测微尺格数)  （3）菌体大小的测定  = 1 \* GB3 \* MERGEFORMAT ①制作酵母水浸片 玻片中央滴一滴蒸馏水，无菌操作用接种环从酵母菌培养液中蘸去菌液并在蒸馏水中涂抹→干燥固定→在涂菌处滴加美蓝染液→盖上盖玻片  = 2 \* GB3 \* MERGEFORMAT ②将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜找到目的物，然后在40倍目镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，