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46 卷 1 期 2006 年 2月 4 日 微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica 46( 1) : 23~ 27 4 February 2006 * 通讯作者。Tel Fax: 86 22 E mail: banrui@ eyou. com 作者简介:应 明( 1974- ) ,女,天津市人,在读博士生,研究方向为分子生物学。E mail: ym8312@ yahoo. com. cn 收稿日期: 2005 05 13;接受日期: 2005 05 27;修回日期: 2005 10 31 枯草芽孢杆菌 ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响 应 明,班 睿 * (天津大学化工学院 天津 300072) 摘 要: CcpA 蛋白是介导枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏( CCR)的全局调控因子, 由 ccpA 基因编码。CCR 效应的 存在影响 B . subtilis 对葡萄糖的利用,降低 B . subtilis 生产发酵产品的效率。采用基因重组技术敲除了核黄素发酵 菌株 B . subtilis24 pMX45 的 ccpA 基因, 构建了 CcpA缺陷株 B . subtilis24A1 pMX45。发酵结果显示: B . subtilis24A1 pMX45 能够在 70h 内基本耗尽 10%的葡萄糖,生物量达到 1 5 109 个细胞 mL,溢流代谢产物积累量减少,在 8%和 10%葡萄糖浓度下, B . subtilis24A1 pMX45 核黄素产量分别比 B . subtilis24 pMX45 提高了 62% 和 95%。CcpA 的缺 陷,可以缓解葡萄糖引起的 CCR效应 ,显著提高菌株的核黄素产量。 关键词: CcpA 蛋白;碳分解代谢物阻遏; 核黄素;发酵 ;枯草芽孢杆菌 中图分类号: Q78 文献标识码: A 文章编号: 0001 6209 ( 2006) 01 0023 05 葡萄糖是大多数原核生物优先利用的碳源,其 分解代谢物对许多基因的表达产生阻遏或激活作 用,引起复杂的生理效应,这种现象称为碳分解代谢 物阻遏效应( CCR 效应) [1] 。葡萄糖引起的 CCR效 应,在 Bacillus subtilis 中已经被广泛研究 [ 2, 3] 。分解 代谢物控制蛋白( Catabolite control protein A, CcpA)作 为主要的调节蛋白, 介导细胞的 CCR效应。CcpA 蛋白与辅助蛋白 HPr Ser46 P 或 Crh Ser46 P 形成复 合物 [ 4] , 作用于靶基因上的分解代谢物响应元件 ( cre boxes) ,抑制或激活靶基因的转录。HPr 是 PTS 系统中的小分子磷酸载体蛋白,当葡萄糖及分解代 谢物存在时, 其 46位丝氨酸残基被磷酸化, 形成 HPr Ser46 P。Crh 蛋白是 HPr 功能类似蛋白。B . subtilis中心代谢中许多基因都存在 cre boxes, 其表 达都受 CcpA 调控。CCR 效应的主要生理表现包 括:控制细胞对葡萄糖及其它碳源吸收和利用 [ 5] ;激 活EMP途径和溢流代谢,导致乙酸、乳酸、羟基丁酮 等发酵产物积累 [ 6] ,引起 pH 值下降,降低细胞比生 长速率;抑制 TCA循环 [ 7] , 降低呼吸和产能效率;增 加无效代谢循环和能量耗费 [ 8] 。 B . subtilis 是生产酶制剂、核苷、维生素等产品 的工业发酵菌株, CCR效应通常导致发酵过程不稳 定,降低发酵单位和收率。在工业发酵过程中,为了 减少 CCR效应的干扰,通常采用葡萄糖流加发酵工 艺,严格控制发酵液中的葡萄糖浓度 [ 9] 。碳源流加 工艺不能从根本上消除 CCR效应,同时还增加发酵 过程控制的复杂性及成本支出。重组 B. subtilis subsp. subtilis 发酵生产核黄素, 是目前核黄素工业 生产中普遍采用的新技术 [ 10] 。但是葡萄糖作为发 酵碳源以及引起的 CCR效应,严重抑制菌体生长及 核黄素合成, 限制了葡萄糖在核黄素发酵中的应 用 [ 11] 。本研究以重组核黄素发酵菌株 B . subtilis24 为出发菌,采用基因重组技术敲除 ccpA 基因, 构建 CcpA缺陷菌株, 并研究了 CcpA 缺陷对细胞生长和 核黄素发酵的影响。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌株和质粒:实验涉及的菌株和质粒见表1。 B . subtilis24 pMX45是能够过量合成核黄素的工程 菌株,质粒 pMX45带有核黄素操纵子,在 B . subtilis 中有两个拷贝。 1 1 2 试剂: 限制性内切酶、T4连接酶、Pyrobest 聚 合酶购自