Toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响.docVIP

　　Toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响 【摘要】 目的 探讨Toll样受体4（TLR4）对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响。方法 小鼠随机分为3组，分别为假手术组和缺血再灌注组、TLR4阻断组，各组又分1、2、3、4 d 4个时间点组。采用TLR4抗体封闭阻断TLR4，ethods After blockade of TLR4 by TLR4 antibody，the expression of TLR4 and interferon (IFN)β at the protEin level in cortex ined by ice ly divided into sham group, ischemia reperfusion group and TLR4 blocking group in different time points （1, 2, 3 d and 4 d）. Results In the right cortex, TLR4 protEIn, IFNβ and TRIF expression of ischemia reperfusion group and TLR4 blocking group（Plt;0.05）. Conclusions TLR4 participates in cerebral ischemia reperfusion by upregulating the expression of TRIF. 【Key ia reperfusion; TLR4; TLR4blocked; TRIF; IFNβ 　　Toll样受体4(TLR4）信号通路包括髓样分化因子88(MyD88) 依赖性 (MyD88途径) 和MyD88 非依赖性（TRIF依赖性）两个途径〔1，2〕。TRIF为TLR4MyD88 非依赖性信号转导途径中的主要接头蛋白。目前，对TLR4介导的TRIF依赖信号通路的研究主要集中在抗感染免疫反应中〔3，4〕，在脑缺血再灌注过程中该信号途径是否发挥作用还没有相关报道。本研究通过观察脑缺血再灌注损伤是否激活TLR4及采用TLR4抗体阻断TLR4后，其胞内衔接蛋白TRIF的表达，探讨TLR4参与脑缺血再灌注的反应机制。 　 　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 　　兔抗TLR4单克隆抗体（sc16240）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗、βactin抗体、山羊抗IFNβ单克隆抗体IgG（sc17569）（美国Santa Cruz 公司）；兔抗TRIF单克隆抗体IgG（1866115184）（美国Geneg/kg），络合碘消毒，行颈部正中切口，分离两侧颈总动脉（CCA)，用动脉夹夹闭小鼠双侧CCA，阻断12 min后，松开动脉夹实现再灌注。在阻断双侧CCA血流后，出现心跳加快、呼吸幅度加深、频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠为缺血成功样本入选。TLR4阻断组小鼠缺血10 min时在右侧CCA内缓慢注入TLR4抗体 (10 μg/ml) 0.1 ml，用微量注射泵在2 min内注射完毕，缝合切口。缺血再灌注组注射等量生理盐水，假手术组只分离双侧CCA，其余步骤同上。术中用白炽灯保持小鼠肛温（37±0.5）℃。术后置清洁饲养笼中观察。 　　1.4 组织切片的准备 　　各组动物分别于再灌注1、2、3、4 d时间点（n=6），用4℃的4%多聚甲醛（含1/1 000 DEPC）经左心室至主动脉灌注200 ml，在前囟尾侧2.6～4.6 mm间冠状切取脑组织块，后固定于上述灌流液中6 h。浸入20%蔗糖溶液中3 h，入30%蔗糖溶液4℃过夜沉底后，常规石蜡包埋，用切片机作连续脑冠状切片（片厚7 μm）。 　　1.5 Western印迹检测TLR4、IFNβ表达 　　各组动物分别于再灌注1、2、3、4 d时间点（n=6）立即冰上断头取右侧皮质，加入适量的细胞裂解液150 μl，超声粉碎，离心。 用Lo. 　　1.6 TRIF免疫组化染色 　　石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）浸泡5 min。3% H2O2去离子水孵育5～10 min，滴加多克隆兔抗鼠IgG（1∶100）4 ℃过夜，加生物素化的羊抗兔IgG（1∶200）室温1 h。DAB显色，常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。 　　1.7 图像分析及统计学处理 　　蛋白条带用自动凝胶成像系统Chemi Imager 5500 V2.03软件进行扫描，用Fluor Chen 2.0软件进行分析测得总光密度值(IDV）。每例动物取切片3张，每张切片选取3个不连续的高倍视野，用Motic Images Advanced 3