TSA抑制NFκB-p50而减轻缺血性脑损伤.docVIP

　　TSA抑制NFκB/p50而减轻缺血性脑损伤 【摘要】 目的： 研究 曲古菌素A（TSA）对缺血再灌注性脑损伤小鼠的保护作用及其可能的分子学机制。 方法 ：小鼠侧脑室立体定位注射TSA；插线法制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型；神经功能评分进行行为学研究；TTC染色检测脑梗死面积；CAO）组及TSA处理（TSA）组，每组各9只。MCAO组侧脑室注射2 μl PBS，TSA组侧脑室注射2 μl TSA溶液（TSA质量浓度为0.5 mg·ml-1），2 h后，这两组（手术组）制作缺血再灌注模型，即缺血2 h后再灌注24 h。 1.2 仪器与试剂 手术显微镜(carl zEiss opmi pi2co100)；显微手术器械；小鼠固定板；1%戊巴比妥钠； 2,3,5氯化三苯基四氮唑(2,3,5triphenyltetrazolium chloride，TTC)、TSA购于美国Sigma公司；多聚甲醛（上海凌风化学试剂有限公司）；鼠脑立体定位仪（上海奥尔科特生物 科技 有限公司）；BCA ProtEIn Assay Kit（PIERCE公司）；兔抗COX2单抗（Santa Cruz公司）；兔抗iNOS单抗（Santa Cruz公司）；兔抗p50单抗(Santa Cruz公司)；鼠源GAPDH单抗（Santa Cruz公司）；抗兔IgGHRP抗体（Santa Cruz公司）；抗鼠IgGHRP抗体（Santa Cruz公司）；ECL plus 试剂盒（PIERCE公司）。 1.3 侧脑室注射 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。随后俯卧，固定于鼠脑立体定位仪上。0.5%碘伏消毒小鼠头顶部皮肤，而后在鼠脑头皮正中做1 cm长纵行切口，暴露前囟门。以前囟门为坐标，选择向右1 mm、向后0.3 mm为侧脑室注射穿刺点，用微量注射器直接进针3 mm后，向侧脑室内缓慢注射2 μl PBS或TSA溶液（TSA浓度为0.5 mg·ml-1）。5 min后，每隔3 min使微量注射器向外拔出1 mm，以防脑脊液迅速流出。待微量注射器全部拔出后，立刻缝合皮肤，并以碘伏消毒。 1.4 局灶性脑缺血再灌注模型 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。颈部略偏右侧切口，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉等，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉距颈总动脉分叉部1～2 mm处剪一小口，插入预先制备好的60尼龙线栓，送至颈总动脉，随之扎紧预留好的丝线，从破口处剪断颈外动脉，松开颈内动脉上的血管夹，并让线栓向颈内方向推送，直到遇到轻微阻力不能再前进为止，此时线段即进入大脑中动脉起始部，测进线深度为1 cm左右。随即松开颈总动脉上的血管夹并缝合皮肤。2 h后，再次麻醉小鼠，抽出栓塞线段至颈外动脉处，遇到阻力即停止。扎紧丝线，剪断血管外多余的丝线。即可实现再灌注。 1.5 神经功能评分 再灌注24 h后，采用Longa 5分法[7]对小鼠的神经功能缺损进行评分。0 分：无神经缺损症状；1 分：左前肢不能完全伸直；2 分：向左旋转；3 分：行走向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～4分为有效模型。 1.6 TTC染色 再灌注24 h后，处死老鼠，快速取出脑组织，放入-70 ℃冰箱中冷冻5～10 min ，自额极向后冠状面切成2 mm 厚的切片，放入1%TTC溶液中，严格避光，37 ℃水浴箱中孵育30 min（每5 min翻动一下脑组织切片）后移置4%多聚甲醛中固定，白色部分为梗死组织，红色部分为正常组织，切片照相，图像经过Orisis 4 数码图像 分析 系统处理， 计算 梗死的总面积。 1.7 蛋白免疫印迹 取上述缺血血管分布区域的皮层，蛋白裂解液裂解组织，蛋白定量（BCA法），95 ℃加热5 min；各取50 μg的蛋白加样到10% SDSPAGE蛋白电泳（40 mA，2.5 h）；电转移蛋白质到硝酸纤维素滤膜（100 V，1.5 h）；5%脱脂奶粉封闭特异性结合位点；弃去封闭液，用TBST洗涤（10 min×3次）；把膜置于塑料袋中，加入1 ml稀释的兔抗COX2单抗（1∶1 000）、兔抗iNOS单抗（1∶1 000）、兔抗p50单抗(1∶500～1 000)包被抗体，4 ℃过夜；次日，TBST洗膜（10 min×3次）后加入1 ml抗兔IgGHRP抗体（1∶2 000，购于Santa Cruz公司），于37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜（10 min×3次）；ECL plus 试剂盒检测蛋白表达。鼠源GAPDH单抗（1∶2 000）为内源性参照。用Quantity One软件对条带的密度进行分析，计算各条带的平均密度值。 1.8 统计学处理 采用