Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌、食管癌中的表达.docVIP

　　Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌、食管癌中的表达 【摘要】 ［目的］ 应用 荧光差异显示技术筛选胃癌中特异表达的基因，并验证其在胃癌、食管癌中的表达，为进一步了解胃癌、食管癌发生、 发展 的分子机制提供帮助。［ 方法 ］ 应用荧光差异显示技术（DD-PCR） 分析 胃癌及其相对应的正常胃黏膜组织，获得差异表达的基因片段，这些片段经过二次PCR再扩增后进行克隆和测序，通过在GenBank中同源性检索，查找与差异片段相对应的同源基因。应用半定量PCR,荧光定量PCR等方法进一步验证该基因在胃癌及食管癌中的表达差异。［结果］ 通过DD-PCR得到的差异片段中的一个片段对应于人Ⅰ型胶原蛋白基因。该基因的读码框长4 395bp，编码1 464个氨基酸，编码蛋白分子量约139.01kD。该基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织，并且在食管癌组织中的表达差异较胃癌中更明显。［结论］ 人Ⅰ型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表达，推测其可能在胃癌及食管癌的发生发展中起作用。 【关键词】 基因 Ⅰ型胶原蛋白 胃肿瘤 食管肿瘤 荧光差异显示 聚合酶链反应 分子生物学 研究 表明癌基因、抑癌基因和细胞周期控制基因的异常表达参与了胃癌及其他恶性肿瘤的演进[1]。 目前 许多胃癌特异表达基因已被鉴定及研究，如p53基因、谷胱甘肽S2转移酶基因等，但胃癌发生、发展的确切机制仍未阐明，因此寻找胃癌中新的特异表达的基因对胃癌的基础研究与临床研究有重要意义。本试验应用荧光差异显示方法（DD-PCR）筛选到胃癌中差异表达的Ⅰ型胶原蛋白基因，并利用mRNA定量分析方法检测该基因在胃癌及食管癌组织中与其对应癌旁组织之间表达的差异。 1 材料与方法 1.1 临床材料 实验中标本来自2006年3月至2006年6月间于江苏大学附属 医院 接受手术 治疗 的胃癌患者12例及食管癌患者14例。每例患者均取手术切除的癌组织及癌旁组织（距离癌组织约2~3cm），并经病理检查证实。组织离体后立即在液氮中速冻，并置于-70℃冰箱中保存。 1.2 试剂和仪器 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，荧光差异显示试剂盒购于Genhunter公司，SuperScriptⅡ反转录试剂盒购于Gibco公司，荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。主要仪器有FMBIO?誖Ⅱ（HITACHI）荧光差异显示系统，STRATAGENE MX3000P荧光定量PCR仪，GenspecⅢ（HITACHI）。 1.3 cDNA的制备 用Trizol提取的方法提取胃癌、食管癌组织及其癌旁组织的RNA，使用Gens-pecⅢ测定总RNA的浓度，经DNase消化后，反转录得到胃癌、食管癌及其癌旁组织的cDNA。 1.4 DD-PCR 3种荧光引物(FHT12A，FHT12G，FHT12C)与21种试剂盒中的随机引物做不同组合，进行荧光差异显示PCR(DD-PCR)，PCR产物8μl上样于6%的聚丙烯酰胺凝胶，1 400V恒压电泳5h左右。 1.5 差异片段的克隆 差异条带经切割和处理后作为模板，进行二次PCR，将产物连接于T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切鉴定后测序(上海生工)。 1.6 荧光定量PCR分析 利用Primer5.0软件设计用于定量PCR的胶原蛋白Ⅰ型基因引物，内参选用人β-actin，检测胶原蛋白Ⅰ型基因在胃癌、食管癌组织及其癌旁组织中表达的差异。引物序列为：胶原蛋白Ⅰ型基因：5-GAGAGCATGACCGATGGAT，3′-ATGTTTTGGTGGT- TCAGGAGG；内参β-actin：5′-GAGACCTT CAACACCCCAGCC，3′-GGAGTACAGGTCTTTGCGGATG。扩增片段长度分别为280bp和512bp。反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 35s。根据2-ΔΔCt公式 计算 基因相对拷贝数，利用SPSS13.0软件对获得的数据进行分析。 1.7 半定量PCR分析 为了对荧光定量PCR的结果进一步检验，用做定量PCR的两对引物对不同模板cDNA分别作了半定量PCR，反应条件为94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 35s 25个循环。通过凝胶成像系统软件对所得电泳条带进行亮度和面积的分析，得出数据，然后用SPSS13.0软件处理，得到直观的图象。 2 结 果 2.1 阳性差异片段的筛选 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，胃癌组织和癌旁组织中基因的表达存在差异性。为进一步了解这些差异片段的信息，将差异片段切出后，进行二次扩增，并对扩增到的片段进行克隆和序列 分析 。将测序获得的序列在NCBI数据库中进行比对，其中编号为G1的差异片段与GenBank中的人