RPHPLC法测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量.docVIP

　　RPHPLC法测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量 【摘要】 目的 采用反相高效液相色谱法建立了测定脑得生片中羟基红花黄色素A含量的 方法 。方法 采用超声波法提取，经大孔树脂HP20纯化后，以反相高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量。色谱柱为Phenomenex Luna C18（5 μm，3.9 mm×150 mm），流动相为甲醇乙腈0.7%磷酸溶液(体积比21∶5∶74)，流速1 .0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长403 nm。结果 羟基红花黄色素A在1.22～9.15 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9998。平均加样回收率为100.93%，RSD为1.73%。结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量。 【关键词】 脑得生片 羟基红花黄色素A 含量测定 大孔树脂 　　脑得生片由三七、川芎、红花、葛根和山楂等组成，具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效［1］。2005年版《 中国 药典》仅以三七皂苷为定量指标对脑得生片进行质量控制［1］。而红花作为该药的重要组成部分之一，其主要有效成分羟基红花黄色素A (hydroxyl safflor yellopoenex Luna C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)色谱柱；流动相为甲醇乙腈0.7%磷酸(体积比21∶5∶74)；检测波长为403 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃。 理论 塔板数以羟基红花黄色素A 计算 不低于3 000；分离度大于1.5；重复性RSD为1.58%；羟基红花黄色素A峰的拖尾因子为1.03。色谱图见图1。 　　图1 羟基红花黄色素A对照品（A），阴性对照（B），供试样品(C)色谱图（略） 　　Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A), negative reference substance HSYA (B) and sample（C） 　　2.2 溶液的制备 　　2．2.1 对照品溶液的配制 　　取羟基红花黄色素A对照品1.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入30%（体积分数）甲醇5 mL，超声溶解后，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度。精密移取5.0 mL，加30%（体积分数）甲醇稀释至10.0 mL，揺匀，制得质量浓度为0.061 mg·mL-1的对照品溶液，密封保存，备用。 　　2．2.2 供试品溶液的制备 　　取脑得生片20片，去糖衣，研细。取1.0 g，精密称定置具塞锥形瓶中，加入30%（体积分数）乙醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液于50 ℃下减压回收至无醇味，然后加纯净水20 mL分散，水分散液过HP20型大孔树脂柱(内径1.5 cm，长10 cm)，以50 mL水洗脱，弃去水液。再用30%（体积分数）乙醇洗脱，收集50 mL，旋蒸仪浓缩至干，加30%（体积分数）甲醇溶解转移至25 mL容量瓶中，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度，揺匀，即得。 　　2.2.3 阴性对照溶液的制备 　　按脑得生片处方比例制成不含红花的阴性对照样品，依“2.2.2”项方法制得阴性对照溶液。 　　2．3 阴性对照试验 　　分别取供试品溶液，阴性对照溶液及对照品溶液，以10 μL进样量，在色谱条件下进行测定，结果表明，阴性无干扰，见图1。 　　2．4 线性范围 　　精密吸取“2.2.1”项对照品溶液0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，1.50 mL，置10 mL容量瓶中，以30%（体积分数）甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照品溶液。 分别进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定HSYA的峰面积，以对照品质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积(A)为纵坐标， 计算 回归方程为：A=5.07409×105ρ-3.2829×104，r=0.9998，结果表明HSYA在1.22～9.15 μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系。 　　2．5 精密度试验 　　分别精密吸取同一批HSYA对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，平行测定6次，测得平均峰面积为3 087 600，RSD为2.16%。 　　2．6 稳定性试验 　　取同一供试品溶液(批号为070302)，每2 h进样1次，体积均为10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定6次，测得样品中HSYA的平均质量浓度为0.0427 mg·mL-1，RSD%为0.87%。结果表明，供试品溶液在10 h内稳定。 　　2．7 重复性试验 　　取同一批号样品(批号为070302)，6份各约1 g，精密称定，按“2.2.2”项制备供试