交泰丸对PCPA失眠大鼠大脑r.docVIP

　　交泰丸对PCPA失眠大鼠大脑r 【摘要】 目的探讨交泰丸镇静催眠的作用机理,为交泰丸进一步开发提供依据。方法选择SD大鼠50只,随机分为正常组,模型组，交泰丸低、中、高剂量组，安定组，采用对氯苯丙氨酸（PCPA）失眠模型，以高效液相检测大脑r-氨基丁酸（GABA）含量变化,免疫组化法检测r-氨基丁酸受体（GABARa1）。结果与模型组相比，交泰丸组可显著增加下丘脑GABA含量及GABARa1受体表达。结论交泰丸可增加模型大鼠大脑r-氨基丁酸含量及受体表达，发挥镇静催眠作用，其作用靶点可能在GABARa1受体。 【关键词】 交泰丸； 失眠模型； r-氨基丁酸； 镇静催眠 　交泰丸源自明·韩懋《韩氏医通》，名见清·王士雄《四科简要方》，由黄连、肉桂两味药物以特殊的配伍比例 (10∶1)组成，具有 交通 心肾，镇静安神的功效，主要用于心肾不交引起的惊悸，夜寐不安等症［1］。与传统 治疗 失眠的苯二氮卓类药物相比，交泰丸的镇静催眠的作用机理可能有所区别，本研究以PCPA大鼠失眠模型为研究对象，观察交泰丸对大鼠大脑中枢神经递质γ-氨基丁酸(GABA)及GABARa1受体影响，以探求其镇静催眠作用机理。 　 　1 仪器与材料 　　1.1 仪器DIONEX Summit高效液相色谱仪（美国DIONEX公司），Chromeleon色谱工作站（美国DIONEX公司），HP1049A电化学检测器（美国安捷伦公司），RC5C低温高速离心机（美国杜邦公司），PHS-2C精密酸度计（上海理达仪器厂）。r-氨基丁酸标准品、3，4－二羟基苄胺（DHBA）(Sigma公司)。 　　1.2 药品黄连（生产批号：081120，厂家：广州致信中药饮片有限公司出品），肉桂（生产批号：080220，厂家：广州致信中药饮片有限公司出品），对氯苯丙胺酸（PCPA），为Sigma公司生产，r-氨基丁酸标准品（ 中国 药检所）、0.9%NaCl注射液（生产批号厂家：广东艾希德药业有限公司）。 　　1.3 动物健康雄性SD大鼠50只，体质量180～220 g，从广州中医药大学实验动物中心购进，并在该动物中心进行饲养。每只大鼠均在相同条件下，自由饮水、摄食，保持 自然 光照。 　 　2 方法 　　2.1 失眠大鼠模型的复制按照Imeri［2］方法,一次性腹腔注射PCPA 300 mg/kg。 30 h后，大鼠出现完全失眠状态。此时分组给药。 　　2.2 分组按随机原则，分为5组，每组10只。分组情况为 A：正常对照组 ；B： 模型组； C：交泰丸高剂量组（6 g/kg）；D：交泰丸中剂量组（4 g/kg）；E：交泰丸低剂量组（2 g/kg）； F：安定组（0.6 mg/kg）。 　　2.3 下丘脑中枢神经递质r-氨基丁酸测定 　　2.3.1 样品制备大鼠断头处死后迅速取出大脑组织。大脑组织加入0．04 mol／L高氯酸2．4ml，超声匀浆，冰浴沉淀30 min；4℃ l0 000 g×15 min离心，取上清，以0.75倍体积加入2mol／L KHCO3中和；3 000 g×5 min离心，取上清溶液低温保存。 　　2.3.2 高效液相法色谱柱：Develosil C30-UG-5（150 mm×4.6 mm, 5 μm，日本Nomura Chemical Co., Ltd）；流动相：磷酸二氢钾溶液（25 mmol/L，内含乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/L，用磷酸调pH 3.4） ∶乙腈 = 98 ∶2（体积比），用前经0.45 μm滤膜真空抽滤，流速1.5 ml/min；玻璃碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，检测电位0.6 V；柱温30 ℃，自动进样器温度10 ℃。 　　2.4 下丘脑GABA受体测定样品制备：冰浴中迅速摘取大脑， 固定液后固定5h(一般大于5 h)后转入20 蔗糖(0．1 mol／L PB，pH 7．4)，4℃过夜至下沉，恒冷箱冷冻切片机作切片，厚30 μm，留作免疫组化法染色。石蜡切片常规脱蜡至水中，置0．01 mol／L柠檬酸盐缓冲液中微波修复10min，每张切片上滴加1g／L Triton溶液50 μl，37℃孵育10 min，PBS洗3 min×3次，滴加封闭用动物血清，37℃孵育15 min滴加GABAR al兔抗(1∶3 000)4℃孵育过夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物索标记山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min，PBS洗3 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS洗3 min×3次，然后DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 　　各组每只大鼠均选取免疫染色切片两张，经HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统对阳性反应区进