产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G.docVIP

　　产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G 作者：袁华 黄训端 张部昌 刘道琴 赵皓 孔小卫 张书祥 【摘要】 糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3O甲基转移酶(EryG)，失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成，积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版，用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG)，其中去除了EryG上S腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒p3，构建了同源重组质粒pΔG。PEG介导原生质体转化法将pΔG转入糖多孢红霉菌A226中，通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体，此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿，糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力。 【关键词】 糖多孢红霉菌； 红霉素； 3O甲基转移酶； 同源重组； 功能补偿 ABSTRACT Saccharopolyspora erythraea erythromycin 3Omethyltransferase (EryG), encoded by the eryG gene, could play an important role in erythromycin biosynthesis, and the inactivation of eryG gene ycin C accumulation in the eryG mutant fermentation culture. Taking Sac. erythraea genomic DNA as a template, about 1,600bp DNA fragment ent ethionine binding domain in eryG gene plified by overlap PCR and cloned into the vector p3 to construct homologous rebination plasmid pΔG. It ediation, and tedia edia utant, A226G-, utant accumulated erythromycin C instead of erythromycin A in the culture. By introducing eryG gene expression vector into A226G- mutant, erythromycin A production eycin; 3Omethyltransferase; Homologous rebination; Function pensation 红霉素(erythromycin，Er)是由革兰阳性细菌糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代谢产物，为一类大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)和红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但在临床上抑菌活性最高，用途最广泛的是ErA［1，2］。 红霉素的生物合成分为两大部分：红霉素母核6脱氧红霉内酯B(6dEB)的合成和6dEB的后修饰。前者由1分子丙酰辅酶A和6分子甲基丙二酸单酰辅酶A在聚酮合成酶复合体(PKS)的催化作用下完成，其过程类似于饱和脂肪酸的合成反应；随后6dEB在红霉素C6位羟基化酶及在C3位和C5位羟基糖基化酶作用下形成了第一个有活性的中间产物ErD；ErD可以先在C12位羟基化酶EryK作用下形成ErC，再在3O甲基转移酶EryG作用下形成ErA，还可以通过另一条次要途径，即ErD先在EryG作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA［1，2］。 红霉素生物合成的基因以单一拷贝、成簇形式存在于糖多孢红霉菌的环形染色体上，质粒不参与红霉素的生物合成［1，3］。 糖多孢红霉菌红霉素EryG是一种S腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基化酶，在ErA生物合成过程中对中间产物ErC和ErD进行甲基化修饰，在降低红霉素的毒性和提高红霉素的活性方面起着重要的作用［1～4］。利用基因敲除技术阻断EryG编码基因(eryG)功能可以积累ErA生物合成的中间产物ErC。本研究构建了红霉素eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体A226G-，为进一步研究EryG与其底物(SAM、ErC和ErD)的定量关系以及EryG的其它相关酶学性质奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)菌种和质粒 糖多孢红霉