低分子量肝素对E选择素介导的HL60细胞与血管内皮细胞黏附的影响.docVIP

　　低分子量肝素对E选择素介导的HL60细胞与血管内皮细胞黏附的影响 作者：宋宝辉 张晓莉 付德才 【摘要】 目的 研究低分子量肝素（LM1单抗，人VEcadheri 单抗（美国 eBioscience），E选择素阻断性单抗（美国Santa Cruz），其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　①HL60 细胞培养于含 10 % 胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养。②人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代培养按Jaffe等〔8〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS(0.01 mol/L，pH7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.1 %胶原酶混合消化液 8～10 ml使血管充盈，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃ 孵育 15 min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁,将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入 50 ml锥形离心管中，加入胎牛血清2 ml终止酶反应。再以30 ml PBS冲洗管腔,流出液倒入离心管,1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，加入含有 10 % 胎牛血清的IMDM培养液,充分混合制成细胞悬液。取0.1 ml细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105/ml接种至塑料培养瓶，置于5%CO2，37℃静止培养12 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔 2 d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。PECAM1和VEcadheri免疫荧光染色鉴定呈阳性，取3代细胞用于实验。 　　1.2.2 体外模拟毛细血管的层流实验 　　用体外模拟毛细血管的层流实验测定HL60细胞与HUVEC黏附作用。所有用于层流实验的单细胞悬液密度均为1×106个/ml，HUVEC单层用TNFα（20 ng/ml）刺激5 h使之表达高水平的E选择素。将覆盖有HUVEC的35 mm培养皿装配于平行板流动小室，然后放置在倒置显微镜的载物台上。倒置显微镜连接有彩色视频摄像装置，可以将视频图像传送到录像机，并可用相连的 计算 机显示器同步观察。首先用注射泵注入PBS（0.1% BSA）冲洗平行板流动小室约 2 min，然后以 1.0 dyn/cm2流速注入HL60细胞单细胞悬液，整个系统保持在22℃。当 HL60 细胞进入视野3 min后，随机选定10～20个区域（10倍），记录黏附于HUVCE单层的白细胞，最后通过观看录像人工计数。在抗体阻断、LMl) 活化的96孔板内融合成单层的HUVEC 5 h,每组3个复孔，PBS洗1次，分别加E选择素单克隆抗体（HAE1f）20 μl/孔,37℃ ，孵育1 h,PBS冲洗。再加1∶50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育30 min，PBS冲洗，然后利用荧光读板仪测荧光强度。 　　1.3 统计分析 　　实验数据以x±s表示。平均值间统计的显著性检验采用ANOVA（方差）检验。如果平均值有显著差异，则通过 Tukey Test 进行多比较成对检验。所有数据均经SPSS13.0统计分析软件包处理。 　　2 结果 　　2.1 HUVEC原代培养及鉴定 　　在倒置显微镜下可观察到，利用Ⅰ型胶原酶消化下HUVEC最初以5～20个细胞的薄片状样结构存在，将消化下来的HUVEC以 2×104个/ml的密度接种于24孔塑料培养板各孔内，待8 h后大部分细胞已经贴壁。早期贴壁的细胞呈小多角、球形，呈团状，少数细胞伸展，此时给细胞换液以去除混入的红细胞等杂质。当培养至24 h时细胞已明显伸展，48～72 h生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有漩涡状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2个核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。培养5 d后融合成细胞单层，呈典型的铺路石状排列。传代培养后的细胞和原代细胞相比无明显变化。免疫荧光标记实验表明，PECAM1和VEcadherin　两种特异性抗原均表达在细胞上，表明培养的细胞为HUVEC。见图1。 　　2.2 LMH 可通过抑制E选择素表达抑制 HL60 细胞与 HUVEC 在动态条件下黏附。见图3。 　　3 讨论 　　肝素是一种高度硫酸化的阴离子糖胺聚糖，具有多种显著的生物活性，尤其是作为抗凝药物在临床上的广泛使用已经将近70年。肝素除了为人所熟知的抗凝活性外，还具有较好的抗炎及抗肿瘤转移活性。作为一些黏附分子的配体（例如选择素和整合素）竞争性抑制黏附分子与