apoB基因多态性研镜目的意义.doc

1.材料和方法 1.1材料 EcoRI、PCR扩增引物序列均参照Gajra B等[1]，MspI位点的PCR扩增引物序列参照Soria LF[2]，3VNTR的PCR扩增引物序列参照罗超权等[3]，引物的序列如下（由上海铂尚生物技术公司合成）： EcoRI 5’primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC MspI 5’primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 3VNTR 5’primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3’primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 模板DNA:健康人口腔黏膜上皮细胞16份(来源随机抽取健康...) PCR MIX（Taq1.25U,dNTP各0.4mM,2×PCR Buffer） EcoRI 酶切体系（10μl PCR产物、18μl双蒸水、2μl EcoRI酶切Buffer、1μl EcoRI限制内切酶（10U/μl）） MspI 酶切体系（10μl PCR产物、18μl双蒸水、2μl Msp I酶切Buffer、1μl MspI限制内切酶（10U/μl）） dNTP、抽提缓冲液（100mM Tris，50mM EDTA，200mM NaCl，0.5% SDS，200ug/ml蛋白酶K，pH 8.0)、酚：氯仿( 1：1) 、氯仿：异戊醇( 24：1)、乙醇、70%乙醇、TE 缓冲液 仪器：凝胶成像系统、BG-Power300电泳仪、ZD-600标准水箱、小型台式告诉冷冻离心机、Hema3200基因扩增仪、0826微型离心机 1.2方法 1.2.1口腔粘膜上皮细胞基因组DNA的提取 将生理盐水漱口液10ml转移至15ml离心管，8000rpm离心10min。倒出上清，管内白色沉淀即为口腔粘膜上皮细胞。用酚/氯仿提取法从外周白细胞提取基因组DNA：将口腔粘膜上皮细胞细胞重悬于0.5 ml 抽提缓冲液, 65℃水浴30分钟, 依次加入等体积的酚：氯仿( 1：1) 和氯仿：异戊醇( 24：1) , 分别抽提1 次。DNA 用乙醇洗淀并经70%乙醇洗涤后室温干燥, 加入适量TE 缓冲液溶解，-20℃保存备用。 1.2.2PCR扩增 PCR扩增反应体系如上，扩增程序分别如下： EcoRI ：94℃预变性7 min ；94℃ 变性1 min, 58℃ 复性与延伸3 min, 进行30 个循 环；最后72℃ 再延伸5min。 MspI：94℃预变性7min；94 ℃ 变性1 min, 60 ℃ 复性1 min, 72 ℃ 延伸1 min，进 行30 个循环；最后72℃ 再延伸5min。 3VNTR：94℃预变性7 min，94℃变性1 min，60℃退火及延伸共4 min，进行30个循环，最后60℃再延伸10min。 1.2.3基因多态性的检测与分型 EcoRI 酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31 μl酶切体系，混匀后37℃酶切12小时，65℃加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照电泳结果。 MspI 酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31 μl酶切体系，混匀后37℃酶切12小时，80℃加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照电泳结果。 3VNTR：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪拍照电泳结果，然后通过软件计算PCR产物的分子量。apoB 3VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成，核心序列重复次数由以下公式估算获得：（扩增片段bp 数—152 bp）/ 15bp 。 2.结果 2.1 apoB 3’VNTR多态性 16个样本DNA经扩增后均出现1-2条带（纯合子为1条带，杂合子为2条带），其中11个样本为杂合子，5个样本为纯合子。共检出片段大小不同的21条带（如图1）。以15bp为一重复单位，重复次数为31-57次。其中以35-36次较多，占40.7%（见图2）。而38次以上和32次以下出现频率较低。 图1.apoB基因VNTR电泳图 图2.apoB基因VNTR重复次数频数分布表 2.2 酶切位点多态性 2.2.1 EcoR I酶切位点多态性 apoB PCR产物酶切后可见两种基因型：12个样本有253 bp、227 bp两条碱基片段，是E+ E+型纯合子；4个样本有480bp、253