免疫层析法测定动物源性食品中磺胺嘧啶残留.docVIP

　　免疫层析法测定动物源性食品中磺胺嘧啶残留 作者：王喜亮 金秀娥 李奎 熊宁 石德时 毕丁仁 【摘要】 建立了动物源性食品中磺胺嘧啶残留的免疫层析快速测定方法。用胶体金标记磺胺嘧啶单克隆抗体作为显色剂，磺胺嘧啶竞争物包被于硝酸纤维素层析膜上作为捕获试剂，采用竞争反应模式制成胶体金免疫层析试纸。该免疫层析试纸可以在15min内完成对磺胺嘧啶残留的半定量检测。读条系统判定灵敏度为5ng/ml，肉眼判定检测限灵敏度为10ng/ml，与其它磺胺类药物无交叉反应。该方法在不同动物源性食品(鸡肉、鸡蛋、鸡肝、猪肉、猪肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在68.1%～118.8%范围内。动物试验样品检测结果表明，该方法与ELISA及HPLC具有好的符合率。该方法灵敏度高,检测准确、简便、快速，有良好的开发应用前景。 【关键词】 胶体金； 免疫层析； 磺胺嘧啶 ABSTRACT An immunochromatographic assay (ICA) al origin. Based on the petitive reaction mechanism, the petitor of sulfadiazine embranes acted as the capture reagent. Colloidal gold onoclonal antibody against sulfadiazine served as the detection reagent. RLs)为0.1mg/kg。目前检测磺胺嘧啶残留的常用方法主要是高效液相色谱法(HPLC)［2，3］和酶联免疫吸附试验(ELISA)［4，5］，该方法灵敏、准确，但需要昂贵的设备， 需要专业人员操作， 而且操作烦琐，检测时间长，成本高，推广使用受到一定限制。免疫层析方法是一种新型的检测方法，具有简便、快速、准确、费用低和不需要专业人员操作等优点，适用于免疫学领域中的快速检测分析。目前，该方法已被应用于药物残留分析［6～8］。 针对磺胺嘧啶残留检测方法存在的缺陷及免疫层析方法的优点，在本研究中我们利用免疫层析方法实现了动物源性食品中磺胺嘧啶残留的的快速检测。 1 材料与方法 1.1 主要材料 冷冻离心机，HITACHI公司；ZX1000点膜仪，CM4000切条机，TSR3000读条系统，BioDot公司；抗SD单克隆抗体，本实验室保存；羊抗鼠IgG，华美生物工程公司；磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲口恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹口恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、克伦特罗、氯金酸(HAuCl4·4H2O)，Sigma公司产品；氯霉素， 中国 药品生物制品检定所；硝酸纤维素膜、玻璃纤维，Millipore公司产品；磺胺嘧啶残留ELISA检测试剂盒，RANDOX公司；高效液相系统，l，搅拌状态下加热至沸腾，加入1%的柠檬酸三钠2ml，搅拌加热15min，室温冷却后，放置4℃存放。 (4)金标抗体的制备 10ml胶体金，用0.1mol/L K2CO3溶液调其pH至8.0，在搅拌状态下，加入一定量的抗SD单抗100μg(将磺胺嘧啶单抗浓度调整到1mg/ml)，混匀，放置30min，加入2.5ml 5%的BSA，混匀，4℃放置1h，4℃ 12000r/min离心30min，弃上清，将沉淀用pH9.0的硼酸缓冲液溶解至10ml；重复离心洗涤两次，沉淀用pH9.0的硼酸缓冲液稀释至1ml。用点膜仪将其均匀的喷涂于玻璃纤维上，冷冻干燥后，密封备用。 (5)免疫层析试纸的制备 免疫层析试纸由吸样材料、玻璃纤维、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水材料和含双面胶的白色塑料板组成(图1A)。用点膜仪在玻璃纤维上喷涂金标抗SD单抗作为显色剂；在NC膜上包被羊抗鼠IgG和BSASD，分别作为对照线(C)和检测线(T)。将吸样材料、玻璃纤维、NC膜、吸水材料依次粘在白色塑料板上，用切条机切成宽3mm的小条制成免疫层析试纸。 (6)免疫层析试纸的检测原理 将试纸插入样品液中，样品在毛细管作用下向上泳动，当泳动至玻璃纤维时，固态化的金标抗SD单抗迅速溶解释放，一起向前泳动至T线，若样品中不含SD，金标抗SD单抗与包被于NC膜上的BSASD发生特异性免疫反应而被截获，在T线形成红色条带，部分金标单抗穿过T线被包被于C线的羊抗鼠IgG截获，形成红色条带(图1B)；反之，若样品中含有SD，SD首先与金标抗SD单抗发生免疫反应，抑制其与T线的SDBSA的结合，使T线截获的金标抗体的量减少，T线颜色变浅，部分金标单抗或其复合物穿过T线被C线截获，形成红色条带(图1C)；T线颜色的深浅与样品中SD的含量成负相关，当样品中SD的量足够大时，T线将无颜色出现，C线出现红色条带(图1D)。 (7