第2章 基因工程的酶学基础.ppt

b. 非放射性标记探针 i）生物素标记探针： 生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R 可以与dNTP酰化结合成为生物素-11-dUTP、生物素-7-dATP、生物素-11-dCTP等。 CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH 纯化的DNA片段 DNase I 制造单链缺口 DNA Pol I 进行切口平移 生物素-dTTP和dNTPs 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 生物素-dTTP 生物素-dTTP ①利用切口平移法将生物素掺入DNA探针中 抗生物素蛋白（avidin）： 链霉抗生物素蛋白（streptavidin）： ②生物素的识别——亲和素： 是一种鸡卵清蛋白。 细菌中avidin的类似物。 能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用： ③偶联酶及其底物 常用的两种酶： 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP） 催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。 酶的作用： 化学发光底物 HRPO和AP的显色反应底物 ii）地高辛标记探针： ①可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，掺入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。 生物素和地高辛标记探针都有商品化的试剂盒 (kit)。 ②地高辛的结合物是抗地高辛抗体。 ③抗地高辛抗体偶联酶及其底物。 用非放射性标记的探针检测原理 生物素 探针序列 目的基因 亲和素 酶 底物 中间产物 显色 发光 探针DNA用生物素或地高辛标记。 亲和素或地高辛抗体与酶偶联。 酶催化一个发光或显色反应。 亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。 2. Klenow fragment 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragment的性质 DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶 ① 3’端补平 5’ 5’ klenow ② DNA 3’末端标记 补平限制性内切酶酶切后形成的3’隐蔽端。 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow （2）主要用途 3’隐蔽末端的DNA片段 Klenow fragment补平 根据末端的顺序选择一种 ?-32P-dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5’----G3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAA3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAATT3’ 3’----CTTAA5’ 5’----G3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GG3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GGATC3’ 3’----CCTAG5’ EcoR I BamH I ?-32P-dATP ?-32P-dGTP 25oC 1h ③ cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 （1） T4 DNA聚合酶的性质 3. T4 DNA聚合酶 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。 有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。 ① 来源 ② 酶活性 ③ 特点 当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP 所对应的位置。 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ T4 DNA聚合酶 无dNTPs T4 DNA聚合酶 有dNTPs 5’ 5’ （2） T4 DNA聚合酶的用途 5’ 5’ T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 ① 补平隐蔽末端 5’ 5’ T4 DNA聚合酶、dNTP T4 DNA聚合酶、dNTP ② DNA 3’末端标记 用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端制造出3’隐蔽端；再利用它的5’?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 标记末端（取代合成法） 加入某种?- 32P-dNTP和dNTPs T4 DNA聚合酶 （3’?5’外切） DNA片段 T4 DNA聚合酶 （5’?3’聚合） 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 无dNTPs 4. T7 DNA聚合酶 （1）来源 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： ① T7基因5编码的大亚基： 有5’?3’聚合酶