大鼠重型颅脑创伤后COX2蛋白表达对学习记忆功能的影响.docVIP

　　大鼠重型颅脑创伤后COX2蛋白表达对学习记忆功能的影响 作者：张涛 朱军 刘清军 李建民 付爱军 【摘要】 　　目的：观察大鼠重型颅脑创伤后COX2的表达及选择性COX2抑制剂NS398对大鼠重型颅脑创伤后 学习 记忆功能的 影响 . 方法 : 采用Marmarous方法建立大鼠重型闭合性颅脑创伤模型, 将成年orris水迷宫 大鼠 0引言 颅脑损伤后的继发性因素是造成脑损伤发生、 发展 的重要原因，其中炎症是脑创伤病理生理过程中的一个重要组成环节. 环氧合酶2（COX2）是花生四烯酸代谢的限速酶,后者产生的前列腺素及血栓素是脑创伤后炎症级联反应的重要介质. 本实验我们应用orris水迷宫测试其对脑创伤后学习记忆的影响. 1材料和方法 1.1材料实验动物取480只健康成年雄性armarous方法［1］造成大鼠重型弥漫性颅脑创伤,致伤高度2 m,致伤物质量450 g. 伤后给予动物人工辅助呼吸及伤口清创缝合. 假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合,但不致伤. 正常对照组不做任何处理. 1.2.2给药NS398纯标准品由美国Neuomarker公司提供, NS398治疗组于伤后即刻给于(40 mg/ kg)腹腔内注射一次，以后给药1次/d, 直至各时相点处死,同时脑创伤组、假手术组及正常对照组给于等量的生理盐水腹腔注射. 1.2.3免疫组化检测于上述伤后各时相点,对动物用100 mL/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，开胸, 40 g/L多聚甲醛经心灌流固定10 min后,取出脑组织,置于40 g/L多聚甲醛后固定12～24 h (4℃). 取出固定液中脑组织标本,常规脱水、石蜡包埋. 冠状面连续切片,厚度约4 μm,经黏片剂处理过的载玻片捞片,置于60℃烤箱烘烤1 h后, 严格按试剂盒说明操作,一抗为兔抗鼠COX2 mAb（天津灏阳生物技术有限公司提供）. 每次实验均设阴性对照,以PBS代替一抗. 胞质有棕褐色颗粒者为COX2阳性细胞. 1.2.4IAS真彩色医学图像 分析 系统软件进行定量分析. 1.2.5Morris水迷宫测试严格按照Smith等［3］的方法,取24只大鼠随机分为脑创伤组、NS398治疗组、假手术组及正常对照组,于伤后7, 8, 9, 10 d进行学习记忆功能测试. 统计学处理: 实验数据用x±s表示，使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验. Plt;0.05为有统计学意义. 2结果 2.1免疫组化正常对照组及假手术组，大鼠海马CA3区及皮层偶见COX2阳性细胞，胞质着色浅淡，阳性细胞以神经元为主. 伤后3 h海马CA3区及皮层COX2蛋白表达呈增强趋势；伤后24 h海马CA3区COX2蛋白表达达峰值； 48 h表达略有下降，而皮层COX2蛋白于伤后48 h表达达峰值； 72 h表达开始下降，至14 d天海马CA3区及皮层COX2蛋白表达仍高于正常值(表1，2, 图1，2), NS398 治疗 组显示自伤后6 h起海马CA3区及皮层COX2蛋白同创伤组相应时相点免疫反应相比明显减轻，且具有显著性差异(Plt;0.05, 图3，4).表1各组COX2蛋白在海马CA3区灰度值表达量表2各组COX2蛋白在皮层灰度值表达量 2.2COX2 r为70×103左右见COX2棕色条带，结果用平均灰度值表示. 结果提示，伤后6 h即出现COX2蛋白表达增强； 创伤组各条带密度值逐渐加深,至伤后48 h COX2表达达峰值， 与假手术组比较极有显著性差异(Plt;0.01)； 随图1脑创伤后24 h海马CA3区COX2的表达×200 2.3Morris水迷宫测试创伤组伤后第9日（Plt;0.01）及第10日（Plt;0.01）搜索安全岛潜伏期较正常组及假手术组明显延长, NS398治疗组较创伤组明显缩短(表4). 3讨论 研究 表明COX2在炎症反应中发挥重要作用,是炎症反应介导的细胞毒性重要的决定因素之一［4］.探讨COX2在脑创伤后引起细胞损伤的机制,不得不提到中枢神经系统中存在的一种很重要的兴奋性受体谷氨酸受体，COX2反应产物PGE2可增强表4各组Morris水迷宫测试搜索安全岛潜伏期离子型谷氨酸受体N 甲基 D天冬氨酸介导的神经毒性作用，引起脑损伤［5］. 另外，COX2是花生四烯酸代谢的必需酶，其代谢产物前列腺素和血栓素A2(TXA2)产生增加，其中TXA2是 目前 已知最强的一种血管收缩因子，并且TXA2和前列腺素具有趋化性,可导致血小板和中性粒细胞黏附于血管内皮细胞，从而加重伤后脑缺血，引起血管通透性变化，神经细胞水肿，加重神经元