液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR.docVIP

　　液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR 【摘要】 microRNA (miRNA)是一组在进化上高度保守、非编码蛋白、参与转录后调节的小分子RNA（19-25核苷酸）。为了进一步明确miRNA的加工机制及功能和定量 研究 miRNA的表达水平， 应用 液相杂交和Northern blot两种 方法 检测miR-28在B细胞淋巴瘤细胞系中的表达并进行了比较。结果表明：液相杂交和Northern blot检测miR-28均显出阳性结果，但液相杂交所用的细胞总RNA量（5 μg）明显少于Northern blot（30 μg），液相杂交的条带信号也较Northern blot的强。结论：液相杂交是一种较Northern blot更为快速、简便和敏感的检测miR-28的方法。 【关键词】 淋巴瘤 　　Expression of miR-28 in B Cell Lymphoma Cell Lines Detected by Solution Hybridization 　　Abstract microRNA (miRNA) is evolutionarily conserved，non-coding small RNA (19-25 nt) involved in post-transcriptional gene regulation.To further understand the biogenesis and functions of miRNA，and to quantify miRNA expression levels，the expression of miR-28 in B lymphoma cell lines iR-28 by solution hybridization and Northern blot shoount used for solution hybridization detection iR-28 in B cell lymphoma cell lines is a faster and more sensitive method as pared iRNA; lymphoma; miR-28 　　microRNA(miRNA)是一种大小约19-25个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过切酶（dicer）加工后生成［1］。miRNA在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，而且在进化上高度保守，在人类已经发现有222个 miRNA。 目前 对miRNA的研究不断深入，并认为这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。 由于miRNA是一类很小的分子，它的表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的 分析 工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，目前研究人员多采用Northern blot方法来检测miRNA的存在［2］。传统的Northern blot方法是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，本研究采用液相杂交（solution hybridization）的方法检测4种B细胞淋巴瘤细胞系中miR-28的表达。miR-28基因是22个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的86个碱基的单链RNA前体经过切酶加工后生成，位于染色体3q27-28的含LIM的脂肪瘤多见融合伙伴（LIM-containing lipoma preferred partner，LPP ）基因中。 　　材料和方法 　　细胞系 　　B细胞淋巴瘤细胞系HRC57、RCK8、BEVA和OCL-LY8，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2及恒定湿度条件下培养。 　　细胞总RNA的提取 　　总RNA提取 　　采用TRIzoL试剂（Life technologies公司）进行RNA一步法提取。取对数生长期细胞1×107，经预冷的PBS 洗涤，移入离心管中，加入1 ml TRIzoL，混匀，室温静置15分钟；加入0.2 ml氯仿，振荡15秒，静置3分钟；4℃、12 000×g离心15分钟，取上清；加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟 ；4℃、12 000×g离心10分钟，弃上清；加1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃、7 500×g离心5分离，弃上清；风干，加入适量的DEPC H2O溶解；-80 ℃保存备用。 　　RNA定量 　　取适当稀释的RNA样品，分别在紫外分光光度计260 nm 和280 nm 波长下读数，按1 OD值40 g/ L RNA 计算 RNA 的含量。 　　miR-28探针制备 　　采用mirV