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　　纳他霉素HPLC检测波长的优化 【摘要】 目的 确定纳他霉素HPLC检测的最佳波长，探讨分光光度扫描与HPLC测定之间的关系。方法 将含量为1～2000μg/ml的纳他霉素甲醇溶液进行全波长扫描，分析各波长下不同浓度范围的线性关系，确定线性关系最佳的波长作为HPLC的检测波长，并测定该波长条件下的理论塔板数、线性范围、精密度、稳定性和回收率。结果 USP26版规定的纳他霉素HPLC检测波长是303nm，但不同浓度下纳他霉素的全波长扫描发现，800μg/ml以下浓度的纳他霉素在303nm处R2为0.383，250nm处为0.993。将纳他霉素HPLC检测波长调整为250nm后，5～2000μg/ml范围内的R2为0.99995；同样条件下303nm处R2达到0.99以上的浓度范围仅为5～200μg/ml。结论 250nm是纳他霉素HPLC检测更合适的波长；全波长扫描时线性关系分析比简单地采用最大吸收波长对HPLC检测波长的选择具有更好的指导性和实用价值。 【关键词】 纳他霉素； 高效液相色谱； 波长 纳他霉素(1)为多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种重要的生物防腐剂［1］。其测定方法有分光光度计分析、比色法分析、微生物分析、滴定分析、纸色谱分析、薄层色谱分析和HPLC分析［2～4］。其中HPLC法的分离度好，能精确定量，分析时间短，是应用最多的方法。 USP26版规定的HPLC分析方法以303nm为检测波长［5］。本公司在产品开发过程中发现，该方法适于检测较低浓度的1，检测较高浓度时则存在较大的误差。本文通过系列浓度的1全波长扫描发现，303nm是线性范围最窄的波长，是造成HPLC分析方法误差的最重要原因。选择合适的波长，可以扩大线性范围。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)设备 UV2550分光光度计(Shimadzu)；1100型高效液相色谱仪(Agilent公司，包括1100型四元泵，G1314A型紫外检测器，G1316A型柱温箱，G1329A型恒温自动进样器，工作站)。 (2)试剂 1样品(本公司生产，批号070703)，乙酸铵、氯化铵为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，色谱纯乙腈购自Merck KGaA公司，分析纯甲醇购自Fischer Scientific公司。 1.2 方法 (1)全波长扫描 准确称取1 200mg，无水甲醇溶解并定容至100ml，分别以甲醇稀释成1500、1000、800、500、400、200、100、80、40、20、10、8、4、2和1μg/ml，以甲醇为对照进行190～450nm的波长扫描。 (2)HPLC测定 HPLC条件 色谱柱大连伊利特Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙酸铵3.0g/L、氯化铵1.0g/L、四氢呋喃5.0ml/L和乙腈240ml/L。柱温30℃；流速0.8ml/min；进样量10μl。 线性关系实验 准确称取1 200mg，无水甲醇溶解并定容至100ml，分别以甲醇稀释成1600、1200、1000、800、400、200、100、50、10和5μg/ml，取样HPLC测定，检测波长为303nm或250nm。 精密度实验 取800、200、50μg/ml的1样品，分别HPLC连续测定5次，检测波长为250nm。 回收率实验 取800μg/ml的1样品甲醇稀释1倍后作为对照，以800μg/ml的1样品分别与400和1000μg/ml的1样品1∶1混匀，作为加样200和500μg/ml的样品，三者在250nm分别连续HPLC检测3次。 稳定性实验 取800μg/ml的1样品，4℃避光保存，分别在0、3、11、13、16h取样HPLC测定，检测波长为250nm。 2 结果 2.1 HPLC检测波长的确定 (1)全波长扫描 2000、1500、1000、800、500、400、200、100、80、40、20、10、8、4、2、1μg/ml的1在190～450nm波长进行扫描(图1)。 (2)全波长线性范围分析 根据2.1(1)扫描结果，分别求出190～350nm波长范围内，1～100、1～200、1～400、1～500、1～800、1～1000、1～1500、1～2000μg/ml各浓度范围的线性系数，并把R2对波长作图，得到各浓度范围全波长线性关系(图2)。 图1 纳他霉素全波长扫描 图2 纳他霉素全波长线性关系图 从图2可以看出，330～340nm波段对除1～2000μg/ml外的各浓度范围线性关系均较好，但该波段是紫外与可见光的交叉波段，浓度降低线性关系也下降。在245～255nm波段，线性关系随着浓度降低而加强，即浓度小于1000μg/ml时，可以确保R2大