组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌型IgA分泌调节的影响.docVIP

　　组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌型IgA分泌调节的影响 【摘要】 目的 通过测定小肠引流液中分泌型IgA（sIgA）的含量，观察组胺对老龄大鼠肠黏膜sIgA的分泌调节。方法 将20只老龄大鼠随机分为对照组（n=10）和实验组（n=10）。制模成功后，实验组大鼠立即给予小肠内100 ng/ml浓度组胺灌注，对照组大鼠用同样方法向小肠内灌注等量生理盐水，4 h后将肠引流液放入超低温冰箱保存待检。结果 对照组大鼠肠引流液中sIgA平均含量为（26.38±12.24）mg/L，实验组大鼠肠引流液中sIgA平均含量为（38.26±15.18）mg/L，对照组大鼠肠引流液中sIgA平均含量明显低于实验组（P＜0.05）。结论 给予小剂量组胺肠内灌注，可促进老龄大鼠肠黏膜sIgA的分泌，增加肠液中sIgA的含量。 【关键词】 组胺；老龄大鼠；肠黏膜免疫；分泌型IgA 肠黏膜免疫是由肠相关淋巴组织的细胞群组成的一种复杂的免疫防御体系，可有效地阻挡肠道内上百种寄生菌及其毒素向肠腔外组织、器官易位〔1〕。aAldrich公司）；羊抗大鼠sIgA单克隆抗体（AbD serotec公司）；兔抗羊二抗（Kirkegard ＆ Perry Laboratories公司）；发光液（Santa Cruz公司）；巯基乙醇（Promega公司）；其他试剂均为国产优级纯或分析纯。 　　1.1.3 主要仪器 台式离心机（上海离心机械研究所）；全自动酶标仪（奥地利）；紫外光分光光度计（日本岛津公司）；超低温冰箱（日本三洋）；电泳仪、半干转槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像分析系统（南京捷达公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验前准备 蒸馏水配制组胺浓度为100 ng/ml，遮光低温保存备用。戊巴比妥钠用蒸馏水配置成1%浓度备用。 　　1.2.2 动物模型制备 20只雄性24月龄SD大鼠称重、编号后，随机分为正常对照组（n=10）和实验组（n=10）。所有大鼠实验前12 h禁食。实验时采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40 mg/kg）。取腹部正中切口，暴露十二指肠、空肠和回肠，在十二指肠和空肠交界处插管接微泵，在回肠末端接引流管。制模成功后，除对照组外，其他大鼠均立即用微泵分别给予小肠内灌注100 ng/ml浓度的组胺，前1 h灌注速度2 ml/h，后3 h灌注速度1 ml/h。对照组用同样方法向小肠内灌注等量的生理盐水。实验过程中肠引流液放置在冰盒中，4 h后将肠引流液移入-80℃超低温冰箱保存。实验过程中无大鼠死亡。 　　1.2.3 肠引流液sIgA检测 ①蛋白定量：采用福林酚试剂法（Loin，待凝胶聚合后，倒掉上层蒸馏水，注入浓缩胶，放置30 min，置于电泳槽中。③电泳：将处理好的样品每孔按含蛋白15 μg加入上样孔中，上槽接负极，下槽接正极，恒流20 mA，待样品进入分离胶后改为40 mA。直到溴酚蓝迁移致距凝胶下端处时关闭电源，停止电泳。④转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，先取三张滤纸放在干转槽负极上，然后将凝胶、转移膜、三张滤纸依次放置，固定好后，恒流电泳45 mA，转移46 min。⑤封闭：转移结束后，将膜置于封闭液中，室温封闭2 h。⑥清洗：用PBS清洗，洗去多余的封闭液。⑦与一抗结合：滴加一抗（用5％BSA 1∶1 500稀释），室温静置过夜。⑧洗膜：Tin，洗去未结合的一抗。⑨与二抗结合：滴加二抗（用5％BSA 1∶5 000稀释），室温静置2 h。洗膜：Tin，洗去未结合的二抗。发光，显影：将电化学发光检测法（ECL）发光液1∶1混合后，滴加至膜上，并用底片曝光后，分别显影、定影。曝光的底片用凝胶成像分析系统拍照并测定积分光密度值。 　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，数据分析均采用两样本均数比较的t检验，方差不齐者采用t′检验，采用SPSS10.0软件进行统计分析。 　 　2 结果 　　对照组大鼠小肠引流液sIgA平均含量为（26.38±12.24）mg/L；实验组大鼠肠引流液sIgA平均含量为（38.26±15.18）mg/L，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验表明给予肠道小剂量组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌sIgA有促进作用。 　 　3 讨论 　　肠黏膜屏障是机体抵御外来病原微生物入侵的重要屏障，肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物屏障等组成〔5〕。其中，肠黏膜免疫屏障发挥着重要作用。sIgA是人类肠黏膜免疫屏障的主要抗体，由双体IgA〔IgA(d)〕、J链和分泌片(SC)共价结合构成。J链和IgA(d)由局部活化B细胞产生，SC由黏膜上皮细胞合成；SC与J链共价结合后与IgA(d)形成二聚体结构即sIgA。sIgA在肠黏膜局部免疫中发挥着重要作用，它们占据着黏膜表面，阻止细菌在肠黏膜表面停