维生素E琥珀酸酯对MCF7乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的影响.docVIP

　　维生素E琥珀酸酯对MCF7乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的影响 .L.编辑。【摘要】 目的 检测维生素E琥珀酸酯（VES）对MCF7乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的 影响 。 方法 人乳腺癌细胞MCF7以VES刺激24h，VES浓度为5μg/ml和10μg/ml。随后以1μM，2.5μM，5μM和10μM的三苯氧胺作用24h，以MTT法测定对细胞增殖的抑制作用，RTPCR法检测VES对HER2 mRNA表达的影响，以免疫组化法检测VES作用前后HER2产物cerbB2表达的变化。结果 TAM对MCF7乳腺癌细胞具有增殖抑制作用，VES处理后，乳腺癌细胞对TAM的敏感性升高。RTPCR显示VES作用后乳腺癌细胞HER2 mRNA转录水平有一定程度的下降，乳腺癌细胞cerbB2的表达降低。结论 VES对MCF7乳腺癌细胞三苯氧胺的敏感性具有增强作用，可能与降低HER2基因表达产物有关。 【关键词】 维生素E琥珀酸酯 乳腺肿瘤 三苯氧胺 敏感性 　　0 引言 　　乳腺癌是一种常见于妇女的激素依赖性恶性肿瘤，内分泌 治疗 是乳腺癌综合治疗措施中的重要一环。对于雌激素受体阳性的乳腺癌常采用内分泌治疗，三苯氧胺是最常用的一线药物。但有报道指出，长期 应用 三苯氧胺后会使乳腺癌细胞产生耐药性从而降低对内分泌治疗的反应。本实验旨在检测新的肿瘤凋亡诱导药物VES对雌激素受体阳性的乳腺癌MCF7细胞三苯氧胺治疗敏感性的影响，并 分析 其对HER2基因表达的调控作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞和主要试剂 　　人乳腺癌细胞株MCF7受赠于上海肿瘤 医院 乳腺中心，VES和三苯氧胺购自SIGMA公司。MTT为AMRESCO产品，RNA抽提试剂盒为安徽优晶公司产品，RTPCR一步法试剂盒为Takara公司产品。 　　1.2 细胞培养和药物作用 　　MCF7细胞以含10%小牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5% CO2的条件下培养。VES和三苯氧胺以无水乙醇溶解，VES实验浓度为5μg/ml 和10μg/ml，三苯氧胺为1μM、2.5μM、5μM和10μM。无水乙醇在培养基内的终浓度lt;2‰。VES作用24h后再以不含药物的培养基培养24h，随后按照上述浓度加入三苯氧胺刺激24h，以MTT法检测药物对细胞的增殖抑制作用。 　　1.3 MTT法检测药物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用 　　乳腺癌细胞以2×104/ml接种于96孔板，每孔200μl，每组设6个复孔。接种细胞24h后加入药物。药物处理结束后每孔加入5g/L MTT 20μl，继续于37℃孵箱培养4h后，弃上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡5min后于自动酶标仪上进行比色，测定波长为492nm吸光值（A）。 计算 药物对乳腺癌细胞的生长抑制率。抑制率（%）=（空白对照组平均A值-实验组平均A值）/空白对照组平均A值×100%。 　　1.4 RTPCR法检测VES对HER2 mRNA表达的影响 　　5μg/ml和10μg/ml VES刺激MCF7细胞24 h后，按照RNA抽提试剂盒的操作步骤抽提总RNA并根据在260nm吸光值进行定量。使用 Takara 一步法RTPCR试剂盒检测HER2 mRNA的表达，引物序列见表1。反应条件为：逆转录65℃，30min。 PCR反应为 30个循环 (解链94℃，30s ；退火 63℃，60s，以及延伸72℃，60s)。反应结束后在1% 琼脂糖凝胶分析逆转录表达产物。以未经VES处理的MCF7细胞设为对照。 　　表1 RTPCR反应引物序列（略） 　　1.5 免疫组化法检测cerbB2 蛋白表达 　　盖玻片置于6孔板内，按细胞培养条件进行细胞培养。5μg/ml和10μg/ml VES作用24h后取出玻片，丙酮固定5min。采用免疫组化链霉素亲合素—生物素化过氧化物酶标方法，经微波修复抗原，按试剂盒说明书操作，检测VES 处理前后cerbB2在MCF7细胞中的表达，以未经VES处理的MCF7细胞设为对照。细胞膜出现棕黄色颗粒的为cerbB2阳性细胞。采用AB值法[1]。A表示显色深浅，0为无显色，1为浅黄色，2为棕黄色，3为棕褐色；B为每个视野染色细胞比例，1为阳性细胞lt;1/3，2为1/3～2/3，3为gt;2/3。每例观察5个高倍视野计算A×B值的平均值。 　　1.6 统计学分析 　　实验数据以均数±标准差表示，用方差分析进行统计学分析。 　　2 结果 　　2.1 TAM对雌激素受体阳性乳腺癌细胞的生长抑制作用 　　0.2%无水乙醇对乳腺癌细胞的增殖无显著影响(Pgt;0.05)。不同浓度的TAM对MCF7细胞具有显著的生长抑制作用(Plt