苦瓜多糖的提取与含量测定.docVIP

　　苦瓜多糖的提取与含量测定 【摘要】 　　以水提醇沉法从苦瓜中提取得到苦瓜多糖,采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量,以正交实验优化显色条件。确定5%苯酚用量1. 0 ml,浓硫酸用量7. 0ml,反应时间30 min。标准曲线回归方程为A=0. 043.2C-0. 005 9,r=0.999 1(n=6),在2. 5～30. 0 mg/L范围内呈良好线性关系。平均回收率为97. 2%,RSD=1. 71% (n=5)。测得多糖平均含量为28. 6%,RSD=1. 84% (n=6)。该法简单、准确、稳定,可为其继续研究开发及应用提供 参考 依据。 【关键词】 苦瓜；多糖；提取；苯酚-硫酸法；含量测定 苦瓜(Momordica Charantia L. )又名凉瓜、癫瓜、癫葡萄、锦荔枝等,是葫芦科苦瓜属植物的果实。它具有良好的食用价值和明显的药用功能,素有“药用蔬菜”之称。 现代 药 理学 研究表明,苦瓜有消暑解热、明目解毒、舒张血管、抗心率失常、抗癌、增强机体免疫力等作用。《 中国 药典》2005年版Ⅰ部等有关资料,均未对苦瓜多糖进行定量检验。本文研究了苯酚硫酸法测定苦瓜多糖含量的方法,以正交设计优化显色条件,对开发、利用苦瓜资源具有一定的参考价值。 　 　1 仪器与试药 (1)仪器:UV-2401PC紫外可见分光光度计(日本岛津);RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); 800型离心沉淀器(上海手术器械厂);Kl,加热回流2次,每次1 h,弃提取液。滤渣挥去乙醇后,用40倍水分三次回流提取,分别提取1. 5 h、0. 5 h、0. 5 h,合并滤液,浓缩。浓缩液中加入乙醇至含醇量达到80%,边加边搅拌,得灰白色沉淀。静置12 h后离心分离沉淀,取固体部分再重复溶解、沉淀、离心分离操作至乙醇液澄清无色为止。沉淀以少许蒸馏水溶解,加入等体积的体积比4∶1的氯仿/正丁醇混合液,振荡20 min,静置,取上清液重复以上操作3次去除蛋白。收集清液,再加入4倍乙醇醇析,取沉淀用乙醚、丙酮反复洗涤,干燥,即可得苦瓜粗多糖固体。 　　2. 2 含量测定 　　(1) 最大吸收波长的选择:最大吸收波长的选择精密吸取225. 1 mg/L苦瓜多糖溶液1. 0 ml, 置10 ml容量瓶中,加入5%苯酚溶液1. 0 ml,混匀,冰浴下再加入7. 0 ml浓硫酸,混匀后室温下放置30min,以蒸馏水补至刻度,混匀。以蒸馏水替代多糖溶液如上法配制空白,在300～600 nm范围内扫描,确定最大吸收波长。确定最大吸收波长为524 nm。(2)显色条件的选择：以显色剂5%苯酚用量、浓硫酸用量和反应间作为考察因素,采用正交设计L9(33)优选最佳色条件,因素与水平见表1。结果见表2,可知,浓酸用量是影响显色条件的最主要因素,显色剂用的影响次之,反应时间的影响相对较小。最佳显条件为A2B3C2,即5%苯酚1. 0ml,浓硫酸7. 5ml,反应时间30 min。(3)标准曲线的制备:精密称取无水葡萄糖纯品62. 5 mg,定容250 ml容量瓶中,分别吸取0. 1, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8,1. 0, 1. 2 ml,按“最大吸收波长的选择”项下方法作,在最优的显色条件下分别测定吸光度。以葡糖浓度(mg/L)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制线,进行线性回归。得标准曲线的回归方程为A=0. 043.2C0. 005 9,r=0.999 1(n=6),在2. 5～30. 0 mg/L范围内呈良好线性关系。(4)样品的测定:精密称取同一苦瓜多糖样品6份各约4 mg,容于10 ml容量瓶,取1. 0 ml,按照制备标准曲的步骤测定其吸光度。根据回归方程 计算 多糖量(校正因子为0. 9［1］)。求得多糖平均含量29. 4%。RSD=1. 84%,表明本法测定苦瓜多糖复性好。(5)精密度实验:取同一份苦瓜多糖溶液,按上述实验确定的件分析样品,同时平行测定6瓶,RSD=1. 13%,见该法测定苦瓜多糖含量的精密度良好。(6)稳定性实验:为了考察苦瓜多糖的显色稳定性,对同一样每隔5 min作一次测定,共测12次。RSD=1. 07%,本法对苦瓜多糖显色至少在1 h内稳定。(7)回收率实验:采用加样回收率法,取苦瓜多糖溶液0. 1 mL份,分别添加已知含量的葡萄糖对照品溶液,测多糖含量。求得平均回收率为97. 2%,RSD=1. 71%。表1 正交因素水平（略）表2 正交实验结果（略） 　 　3 讨论 多糖含量的测定至今大多采用Dubois等提出的苯酚硫酸比色法［1］,其原理是多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖,并迅速脱水成糠醛衍生物,此糠醛衍生物与苯酚缩合生成有色化合物。本文以正交设计L9(33)优化显色条件,确定