花果山银杏叶中黄酮化合物的提取与测定.docVIP

　　花果山银杏叶中黄酮化合物的提取与测定 作者：胡喜兰 程青芳 尹福军 李静 【摘要】 目的为适时采收，合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系。方法通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，利用HPLC法测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，同时利用DPPH·法测定其抗氧化活性并加以比较。结果发现不同树龄的银杏叶黄酮含量差异较大，不同生长季节含量存在着差异，春季含量高于秋季；银杏叶提取物的抗氧化活性与黄酮含量基本成正比关系。结论春季采收银杏叶有利于黄酮化合物的开发利用。 【关键词】 银杏叶； 黄酮； 提取； 测定 银杏叶是银杏科银杏属植物Ginkgo biloba L.的叶子。我国自古以来就认为银杏叶的性味甘、苦、涩、平，归心、肺经。本草纲目中记载银杏具有“敛肺平喘，止遗尿、白带”的功效［1～3］。可用于 治疗 肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂等症［4,5］。其药用价值日益引起国际医药、化学和植物学界的重视，开始了对银杏叶的综合开发利用和研究。为适时采收合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系，本文通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，探索HPLC法的最佳色谱条件，测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，为进一步研究提供依据。 　 　1 仪器与材料 紫外分光光度仪：日本岛津公司；B-220型恒温水浴锅：浙江舟山市定海区海源仪器厂；KS-150D型超声波清洗器：宁波科生仪器厂；SHZ-CD 型循环水式多用真空泵：浙江舟山市定海区海源仪器厂；AX=210g d=0.01mg）：北京塞多利斯天平有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；XA-1 型固体粉碎机：金坛市科兴仪器厂；SK-1快速混匀器：常州国华电器有限公司。 样品1： 4月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品2： 4月下旬采于花果山九龙桥百年银杏树；样品3： 4月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树；样品4：头年10月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品5：头年10月下旬采于连云港花果山九龙桥百年银杏树；样品6：头年10月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树。6种样品叶均于55℃恒温干燥后，粉碎过筛，置于磨口瓶中，密闭避光保存。 槲皮素、山萘酚标准品( 中国 药品生物制品鉴定所出品)异鼠李素标准品(Biochemika公司)，DPPH·（1,1-二苯-2-苦肼基 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，Sigma 公司），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司出品）。甲醇、盐酸、磷酸、醋酸等均为分析纯试剂，水为去离子水(自制)。 　 　2 方法 　　2.1 黄酮标准品溶液的制备 　　2.1.1 山萘酚标准储备液准确称取4.65 mg的山萘酚，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。 　　2.1.2 槲皮素标准储备液准确称取28.8 mg的槲皮素，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。 　　2.1.3 异鼠李素标准储备液准确称取5.00 mg的异鼠李素，加甲醇溶解，完全转移并定容至50.0 ml容量瓶中备用。 　　用时分别精密吸取一定量的上述储备液加甲醇稀释至一定刻度，摇匀即可。 　　2.2 样品溶液制备分别称取6种样品0.8 g，置于100 ml圆底烧瓶中，加入25 ml甲醇/25%盐酸（4∶1）混合液，闭塞称重，置于水浴中沸腾回流1 h，取出后冷却至室温，称重，以甲醇补足减失重量，过滤后转移至50 ml容量瓶，作为样品溶液1～6号。 　　2.3 标准溶液最大吸收波长测定分别将槲皮素、山萘酚和异鼠李素标准品及样品溶液用紫外分光光度仪在200～800 nm进行扫描，获得最大吸收波长并加以选择，以防止其他成分干扰。 　　2.4 最佳色谱条件测定通过对流动相中水和甲醇比值、流速及缓冲溶液的选择等多个方面的改变，获得将槲皮素、山萘酚和异鼠李素分离的最佳条件。 　　2.5 标准曲线的制作取标准品溶液，在最佳色谱条件下，分别进样2.5，5，10，15，20，30 μl，以峰面积（mV/min）为纵坐标Y，以进样量（μg）为横坐标X，分别作槲皮素、山萘酚和异鼠李素线性回归曲线。 　　2.6 样品中槲皮素、山萘酚和异鼠李素含量测定和 计算 取“2.2”制备的样品液（1～6号）1 ml分别稀释于10 ml容量瓶中，在最佳色谱条件下，各进样15 μl，测样品中槲皮素、异鼠李素、山萘酚的峰面积A1，A2，A3，由3者的标准曲线及回归方程，采用外标法，获得进样黄酮量，按下式算出槲皮素、山萘酚和异鼠李素的含量。 　　C=（X/15×250）/m样品 　　式中：C-