蛋白酶体抑制剂DCI对胃癌细胞增殖的影响.docVIP

　　蛋白酶体抑制剂DCI对胃癌细胞增殖的影响 【摘要】 目的:探讨蛋白酶体抑制剂3，4二氯异香豆素(DCI )对人胃癌细胞系BGC823体外增殖和凋亡的 影响 。 方法 :将DCI加入BGC823胃癌细胞,采用MTT法检测细胞的生长抑制效应,Annexin Ⅴ/PI法及电镜观察DCI对细胞凋亡的诱导作用。结果:DCI可明显抑制BGC823细胞体外增殖,随着DIC浓度的增加和处理时间的延长,细胞凋亡率增加; 流式细胞术显示DCI可诱导胃癌细胞早期凋亡，细胞被阻滞在G1期；电镜观察发现,经DCI处理后的部分细胞具有凋亡细胞的典型形态特征。结论:DCI可抑制人胃癌BGC823细胞增殖并促进其凋亡。 【关键词】 蛋白酶体抑制剂;胃癌;细胞凋亡；细胞增殖 　泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome patharin,DCI )同样具有抑制蛋白酶体的功能，对肿瘤细胞也有抑制作用，本研究观察其对胃癌细胞生长增殖的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞与培养 人胃癌细胞BGC823购自上海细胞中心，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,在37℃、5%CO2培养箱中培养，使用时以0.25%胰蛋白酶消化。 　　1.1.2 试剂 DCI 购自Santa Cruz公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)中,配成浓度为50 mmol·L-1的贮存液,4℃保存,用时稀释；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；RPMI 1640培养基购自Gibco公司；流式细胞仪为美国BD公司FACS calibur型号；酶标仪为BIORED 550型。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT法测细胞生长抑制效应 取对数生长期细胞接种于96 孔板,每孔5×103个细胞,孵育过夜后,实验组分别予终浓度为25、50、100、200、400、600、800 μmol·L-1 DCI,对照组予不含DCI的培养液,每组设3个复孔,各组分别培养6、12、24、48 h,用MTT法测每孔吸光度（A）值。 　　1.2.2 Annexin Ⅴ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布 实验组分别用终浓度为150、300 μmol·L-1 的DCI处理BGC823细胞,对照组予不含DCI的培养液,均继续培养24 h后收集细胞,用PBS洗2次,采用Annexin Ⅴ和PI荧光染色、流式细胞术定量 分析 细胞凋亡状况及周期分布。 　　1.2.3 细胞超微结构观察 收集经300μmol·L-1 的DCI处理24 h后的BGC823细胞及未经DCI处理的对照组细胞,戊二醛和锇酸双重固定,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色,透射电镜观察。 　　1.3 统计学处理数据用x-±s表示， 应用 SPSS 10.0软件Probit(概率单位法) 计算 ，并行线性回归分析。 　　2 结果 　　2.1 DCI对胃癌细胞增殖的影响MTT法检测结果显示，100～800μmol·L-1的DCI对胃癌细胞均有抑制作用，见表1,12、24 h 的IC50 分别为478和398μmol·L–1。24 h回归方程为Y=-000104X±0.91476,其中Y、X 分别为细胞率和DCI的浓度。Y和X的相关系数r为0.98,Plt;0.01。 　　表1 MTT法检测DCI对胃癌细胞增殖的影响（略） 　　2.2 DCI对BGC823细胞周期分布和凋亡率的影响DCI作用于BGC823细胞24 h后收集细胞,用流式细胞术检测细胞周期,各个周期细胞百分比改变见图1。150和300μmol·L–1 浓度的DCI处理BGC823细胞,G0/G1期细胞增加,而G2和S/M期细胞明显减少（表2）。图2表示DCI作用24h后细胞的凋亡率。经流式细胞术检测，正常培养的BGC823细胞凋亡率为2.54%，而经150μmol·L–1DCI作用后,凋亡率已达18.27%,G1期前出现凋亡峰，DCI浓度为300μmol·L-1时,细胞凋亡率达23.86%,显示DCI诱导的BGC823细胞凋亡具有量效关系。 　　2.3 透射电镜观察结果对照组细胞体积大,细胞器丰富,染色质均匀(图3A)。经DCI作用后部分BGC823细胞出现细胞凋亡的形态学特征:细胞体积缩小,胞浆浓缩,细胞器减少,出现空泡，染色质固缩、边缘化,并形成凋亡小体(图3B)。 　　3 讨论 　　蛋白酶体抑制剂可有效地诱导恶性、增殖程度高的细胞凋亡,对正常细胞几乎无作用,从而成为 治疗 肿瘤的新途径[6]。DCI最初是作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，随后有多项研究显示DCI对UPP有明显抑制作用。早老素可以诱导AlzhEimer病发生，其降解主要依靠蛋白酶体系统降解，蛋白酶体抑制MG13