第08章节电泳的技术hu.pptVIP

第八章 电泳技术 第八章 电泳技术 第一节 电泳技术发展简史 第二节 电泳的基本原理 第三节 影晌电泳分离的主要因素 第四节 电泳的分类 第五节 各种电泳技术介绍 第六节 电泳测纯技术 第一节 电泳技术发展简史 1809年，俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年，Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年，瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年，Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了研究。 上世纪50年代起，特别是1950年，Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。 聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 上个世纪80年代发展起来的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。 第二节 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。 Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。 样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。 支持介质：滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶薄层平板、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。 电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。 电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。 垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。 稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F）等于分子所带净电荷量（q）与电场强度（E）的乘积。即： F＝qE 带电分子移动过程中，会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（Fˊ）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，Fˊ的大小服从Stoke定律，即：Fˊ=6πrηυ r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度（或介质粘滞系数），υ是电泳速度(单位：cm/s )。 当带电分子匀速移动时： F = F’ ∴ qE = 6πrηυ υ=qE/6πrη 电泳迁移率（m）：单位电场强度下的迁移速度： m = υ/E = q/6πrη 电泳迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。 带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。 即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。 有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳； 有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第三节 影晌电泳分离的主要因素 3.1 待分离生物大分子的性质 3.2 缓冲液的性质 3.3 电场强度 3.4 电渗 3.5 支持介质的筛孔 3.1 待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会