含bcl2启动子绿荧光病毒载体的构建及在白血病HL60和K562细胞中的表达.docVIP

　　含bcl2启动子绿荧光病毒载体的构建及在白血病HL60和K562细胞中的表达 【摘要】 目的 应用pEGFP1质粒构建含有bcl2启动子(bcl2P)的载体，转染高表达bcl2的HL60细胞和低表达bcl2的K562细胞，测定绿荧光蛋白在2种细胞中的表达程度，观察特异性启动子能否引导目的基因在靶细胞表达，达到基因定位的目的。 方法 克隆bcl2P，采用pEGFP1质粒构建含有bcl2P的载体；应用电击法转染pEGFPBCL2P DNA到HL60和K562细胞并培养；测定EGFP在HL60细胞和K562细胞中的表达。 结果 成功构建含bcl2P绿荧光病毒载体pEGFPBCL2P，绿荧光的表达率在HL60及K562细胞分别为64.29%及0.5%。表达绿荧光阳性的HL60细胞在培养30 d后仍有89.6%的细胞表达阳性。 结论 绿荧光在HL60细胞中有较稳定的高表达，而在K562细胞中几乎不表达，说明特异的bcl2P能引导目的基因在靶细胞表达，可能成为基因定位的一种方法。 【关键词】 基因，bcl2； 启动区(遗传学)； 流式细胞术； 白血病 基因 治疗 能否取得成功除其有效性之外，能否精确定位到靶细胞并在靶细胞中表达至关重要。应用肿瘤特异性抗原为启动子引导目的基因定位于肿瘤细胞，是肿瘤基因治疗的一条新途径。近年来，已有采用特异性启动子引导目的基因定位于肝癌、乳腺癌和前列腺癌细胞的实验报道。本研究应用pEGFP1质粒构建含有bcl2P的载体，转染高表达bcl2的HL60细胞和低表达bcl2的K562细胞，测定绿荧光蛋白在2种细胞中的表达程度，观察特异性启动子能否引导目的基因在细胞的表达，达到基因定位的目的。 1 材料和方法 1.1 材料 酶及试剂 限制性内切酶PstI、BamH I和XBaI,T4DNA连接酶、PCR试剂（美国Promega公司），限制性内切酶ApaI（美国Pharmacia Biotech公司）。质粒：pEGFP1载体、G418（美国Clontech公司）,DH5α感受态细胞（美国Live Technologies公司），以CaCl2方法制成感受态细胞。在pEGFP1载体多克隆位点（MCS）中PstIApaI位点，插入bcl2 promoter基因编码区，片段长330 bp。 1.2 方法 1.2.1 克隆bcl2P 从HL60细胞中提取DNA，根据人bcl2P序列（330 bp）设计bcl2P引物（28 bp）,其序列为： 上游：5’ATGGATCCGGGCCAGGGACGGGCGGAGG3’ 下游：5’GCTCTAGACGCAGCCCGCTCCGAGCGCT3’ 用上述引物各5 μL，Taq Buffer 10 μL，Taq酶0.5 μL，在PCR仪（2400型，美国PE公司）扩增，94 ℃ 40 s→63 ℃ 2 min→72 ℃ 2 min，35个循环，72 ℃ 10 min→4 ℃ 10 min。 1.2.2 扩增和回收PCR产物 扩增得到的DNA电泳，低融点胶回收，用Gle Extraction Kit(QIAGEX II)提纯。按Promega操作说明插入pBSK载体后转化到DH5α感受态大肠杆菌中，筛选出含bcl2P目的基因质粒的菌落，提取酶切鉴定后，命名为PBSKBCL2P。将所选出的含bcl2P目的基因质粒的大肠杆菌进行测序。用限制性内切酶BamH I和XBaI酶解质粒PBSKBCL2P，电泳，低融点胶回收bcl2P DNA片段，溶于TE中，-20 ℃保存。对扩增的bcl2P DNA进行鉴定后，用酶切的方法把bcl2P DNA拼接到载体pEGFP1（该载体带绿荧光蛋白p基因）多克隆位点（MCS）上，建立pEGFPBCL2p载体，用大肠杆菌扩增pEGFPBCL2P DNA。 1.2.3 应用电击法转染pEGFPBCL2P DNA到HL60和K562细胞 收获HL60和K562细胞，用PBS洗涤2次，加入10 μg的pEGFPBCL2P DNA，放在冰水中孵浴5 min后取出，常温下用300 V、500 μF电击，收集细胞在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、含有G418的培养液中培养48～72 h。另收集带荧光的细胞进行长期培养。 1.2.4 测定pEGFP在HL60细胞和K562细胞中的表达 收获培养后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞数为1×106 mL1，用流式细胞仪测定。用荧光显微镜观测荧光在细胞中的表达程度。 2 结 果 2.1 目的基因的克隆和测序 以HL60细胞bcl2P基因组DNA为模板，克隆出bcl2