新生鼠坏死性小肠结肠炎肠细胞凋亡率变化及意义.docVIP

　　新生鼠坏死性小肠结肠炎肠细胞凋亡率变化及意义 作者：董海英， 刘健， 陈兢芳， 卓玲， 杨燕珍， 吴斌 【摘要】 　　目的 探讨新生鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)肠细胞凋亡率变化及其与肠组织损伤程度的关系。 方法 出生48 h的SD大鼠16只随机分成模型组和对照组，每组8只。模型组给予鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立NEC模型；对照组与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。实验结束后24 h处死大鼠，留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织进行肠组织损伤评分和肠细胞凋亡率检测。每组随机抽取2例回盲部近端小肠进行肠黏膜透射电镜检查。 结果 模型组肠组织学改变与NEC时改变一致，透射电镜显示肠黏膜出现大量凋亡细胞，部分形成凋亡小体。模型组和对照组肠组织损伤评分分别为（3.33±0.59）和（0.13±0.17）；肠细胞凋亡率分别为（31.0±10.6）%和（4.6±3.9）%；二者比较差别均有统计学意义。肠细胞凋亡率与肠组织损伤评分呈显著正相关(r=0.771，Plt;0.01)。 结论 NEC时肠细胞凋亡明显增加。肠细胞凋亡可能是造成新生鼠NEC肠道进行性损伤的病理基础。 【关键词】 小肠结肠炎,伪膜性； 婴儿； 新生，疾病；疾病模型，动物； 细胞凋亡 　　坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿时期严重的肠道炎症性疾病，是新生儿重症监护病房中最常见的外科急症。虽然大量研究证实NEC发病与早产、肠管缺氧缺血、肠内喂养、细菌感染等有关，但其确切发病机制仍不明确[12]。近年来研究证实，胃肠道屏障功能受损是胃肠功能障碍发生的病理基础，是多种严重疾病和器官损伤的共同病理生理过程；其中，胃肠上皮细胞结构的完整是维持其屏障功能的形态学基础，肠上皮细胞及细胞间相互连接紧密程度及其完整性决定肠黏膜屏障通透性[2]。本研究通过人工喂养、缺氧和冷刺激复制新生大鼠NEC模型，采用流式细胞仪检测肠细胞凋亡率，结合肠组织损伤评分、肠黏膜电镜观察，探讨新生大鼠NEC发病过程中肠细胞凋亡率变化及其与肠损伤的关系，为阐明NEC的发病机制、寻找直接有效的 治疗 药物提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物及分组 清洁级新生SD大鼠16只，出生lt;48 h，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)20070005]。剔除每胎gt;12只或每胎lt;6只者。每窝5～6只，雌雄不限，体质量5～10 g。生后48 h随机分成模型组和对照组，每组各8只。模型组新生大鼠与母鼠分开，置入保育箱中，采用鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立新生鼠NEC动物模型[3]；对照组继续与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。NEC模型组在造模结束后24 h和对照组新生鼠空腹断头处死，打开腹腔取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织。 　　1.2 主要试剂 雅培加营素蛋白质粉由美国雅培公司提供；低出生体质量婴儿配方奶粉由雀巢公司提供；中/长链脂肪乳注射液(C6～24)购自华瑞制药有限公司。胃蛋白酶(美国Sigma 公司)；Aanxin V/PI试剂盒(美国贝克曼公司)。根据实验要求，自制新生鼠保育箱，保育箱内环境温度、湿度用Hygro 电子 温湿度计24 h监测。 　　1.3 方法 　　1.3.1 病 理学 检查 取回盲部近端肠管1 cm置于10%甲醛中固定，石蜡包埋，取冠状切面，HE染色后在光镜下观察肠组织形态学改变。采用双盲法进行肠组织损伤评分。参照 　 　3 讨论 　　肠黏膜细胞结构破坏是肠功能障碍发生的病理基础，也是多种严重疾病和器官损伤的共同病理生理过程。肠黏膜受到早产、肠管缺氧缺血、肠内喂养、细菌感染等损伤刺激后引起的损伤导致肠细胞坏死，在NEC初期仅表现为黏膜层损伤，后期则表现为整个肠壁透壁性坏死。传统观念认为，新生儿NEC导致的肠黏膜损伤是坏死；研究证实，虽然末期NEC组织病 理学 表现为典型肠组织广泛坏死，但在疾病完全 发展 之前，肠细胞凋亡可能是起始的肠黏膜细胞主要死亡方式，肠细胞凋亡改变可能导致其易于罹患NEC[12]。Clark等研究显示，表皮生长因子可保护肠道上皮细胞免于凋亡，从而减少新生鼠NEC发病率[4]。Feng等研究显示，给予肝素表皮生长因子可能通过下调肠细胞凋亡，维持肠黏膜屏障完整性，从而降低新生鼠NEC发病率和严重性[5]。Jilling等研究表明，配方奶喂养结合寒冷与缺氧冷刺激新生鼠小肠导致组织学改变与NEC时组织学改变一致；与母乳喂养的对照组相比，NEC模型组新生鼠肠黏膜有明显细胞凋亡存在，肠细胞凋亡是最早的大体形态变化，给予