3-1+细胞生物学研究方法要点.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 科学实验思路及模式生物 一、细胞形态结构的观察方法 二、 细胞组分的分析方法 三、细胞培养、细胞工程与显微操作技术 1.病毒 特点： 结构简单，基因组小，繁殖快，适合遗传操作。 应用：基因表达调控、生物大分子相互作用、生命物质自组装以及肿瘤的发生与防治。 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy） 以可见光或不可见光为光源。 二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 以电子束为光源 三、扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope，STM ) 隧道效应 P49图3-1 （一）普通复式光学显微镜技术 1.光镜的基本构造和成像原理 2.几个相关概念 3.光镜样本制作 (二) 相差显微镜（phase-contrast microscope） ●发明：相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。 ●原理：普通光镜下观察标本时，是靠颜色（波长）和亮度（振幅）的差别而看到被检物体的结构，而活细胞近于无色透明，光波通过不吸收光，振幅变化不大，故人眼感觉不到。把透过标本的可见光的光程差或相位差转换成振幅差，从而提高了密度不同的结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1.环形光阑（annlar diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 2.相差板（annlar phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 (三) 微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转 化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研 究活细胞中较大的细胞器。 DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 （四）录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的细胞器甚至微管上颗粒的运动。 录像增差显微镜技术 （五）荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） （六）激光扫描共焦显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy， LCSM ） 原理：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，大约是普通光学显微镜的3倍。通过计算机分析和模拟，可重构样品的三维结构。 应用：可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 P55 图3-8 （七）暗视野显微镜（darkfield microscope） 聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，可使反差增大，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 适于观察细胞的运动和外部形态，而内部结构观察不清。 （八）倒置显微镜（inverted microscope）  物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 当代显微镜的发展趋势 注重实用性和多功能方面的改进； 采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体； 自动化与电子化。 （九）荧光共振能量转移技术（FRET） 原理：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的