β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析.docVIP

　　β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析 作者：李黄金,陈伟,赵林,黄志健 【摘要】 目的 构建含εNH2标记位点的克隆酶供体免疫分析(CEDIA)系统供体片段。方法 从大肠杆菌基因组克隆β半乳糖苷酶(βgal)的α片段基因，通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变，与硫氧环蛋白(Trx)融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析。结果 克隆的α片段为βgal N端1-56多肽片段，定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上，且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性，其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的，且与野生型α片段的基本一致。结论 α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力。 【关键词】 β半乳糖苷酶;供体;标记位点;互补 　　(School of Life Sciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou,Guangdong 510006,China)Abstract:Objective To introduce an internal εNH2 for conjugated analyte into donor of cloned enzyme donor immunoassay ( CEDIA ).Methods α gene of βgalactosidase Escherichia coli,and introduced lysine code by sitespecific mutagenesis. α genes oter T7 in E. coli Origami (DE3),then screened by plementation assay ent after purification.Results An αgene coding 156 aa utants R14K、R53K and R14K/R53K utants,R53K shoent’s and far higher than other mutants’.Conclusion Mutant R53K could be potentially used as a donor containing internal εNH2 for CEDIA. 　　Key entation 　　克隆酶供体免疫分析(cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA)技术是一种基于β半乳糖苷酶(βgal)α互补的均相酶免疫分析技术[1]，由于特异性强、灵敏度高、且操作简单而快速，目前已广泛应用于临床检验、药物滥用筛查、食品有害残留检测与环境污染监控等方面[2，6]。CEDIA系统由βgal酶供体(α片段)、受体(Δα片段)、标记抗原(待测物)和抗体组成，抗体与标记抗原的结合可导致βgal互补活性的下降，而当样品中含有待测抗原时，待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，并最终表现为样品中的抗原浓度与酶活性呈正相关。由于对受体片段的任何化学修饰均会导致其互补活性的丧失[7]，所以抗原只能标记于较小的供体片段。εNH2是最具标记活性的基团之一[8]，但天然供体片段中缺乏含εNH2的赖氨酸。本文报道了一种含εNH2基的、具有作为CEDIA供体片段潜力的βgal α片段突变体。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本室保存，大肠杆菌Origami(DE3)和表达载体pET32a 为Novagen公司产品;Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA lader和蛋白质Marker等均为大连宝生物工程有限公司产品;PCR产物回收试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自百泰克生物技术有限公司;HisTrap FF柱(1 mL)为GE公司产品;BCA试剂盒为广州美津生物技术有限公司产品;咪唑(分析纯)为广州化学试剂厂产品;Tanon4100全自动数码凝胶图像分析系统为上海天能科技有限公司产品。 　　1.2 引物设计与合成 　　α片段克隆与突变用上游引物分别为αF和αFM，αF的序列为5′TAGCCATGGGTTCACTGG CCGTCGTTTTAC3′，αFM的序列为5′TAG CCATGGGTTCACTGGCCGTCGTTTTACAAAAGCGTG ACTGGGAAAAC3′， 其中下划线处为NcoⅠ位点;α片段克隆与突变用下游引物分别为αR和αRM，αR的序列为5′TAGGGATCCTTAATGA