分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制.docVIP

　　分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制 【摘要】 目的 探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。 方法 采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来 研究 其生物分子学机制。结果 鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-кB抑制剂MG132 大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-кB。结论 钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。 【关键词】 人工髋关节置换术 钛颗粒 骨溶解 肿瘤坏死因子 【Abstract】 Objective To study the mechanism of osteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α (TNF-α) release in macrophages stimulated prosthesis. Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages particles ade and study the mechanism of TNF-α release by Elisa/SA. Results TNF-α urine macrophage stimulated by titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-κB (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release. Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κB onstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as ble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。 而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。与此同时, Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。 这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。 但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来 分析 TNF-α合成的分子生物学机制。 1 材料与方法 1.1 材料 DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于Gibco Invitrogen 公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem (La Jola CA)。抗磷酸-ERK /JNK/IkBα抗体来自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。测定鼠TNF-α ELISA 试剂盒来自于BioSource international(Madison O)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataa公司。 1.2 细胞培养 RAEM 培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔） 或60mm 组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。上清液及细胞收集后用于进一步分析。 1.3 钛颗粒准备 钛颗粒（1～3μm）来自于 Cerac(Milulus Amebocyte Lysate 方法（Biol以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。 1.4