出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究.docVIP

　　出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究 出口海水网箱养殖鱼类病害调查研究 　　为了提高海水养殖鱼类品质、规范养殖生产、减少养殖自身污染、保障鱼类食用安全和出口质量，本文作者开展了出口海水网箱养殖鱼类的病害调查研究。对浙江省台州海域8个养殖区域(其中玉环5个、温岭2个、乐清1个)进行周年实地调查，及时取样，实验与分析相结合的方法，通过相关县市水产技术推广站每年提供的数据等获取流行病学资料，按流行病学统计方法进行资料分析和处理。结果显示，海水网箱养殖鱼类细菌性病害仍是危害养殖生产的最常见、影响最大、经济损失最严重的病害。 　　 　　1　实验对象和方法 　　 　　1.1实验对象 　　以鲈鱼、美国红鱼、黑鲷、真鲷等主要品种为调查实验对象。分4个不同季节对8个养殖区域随机抽样检测分析。 　　 　　1.2常规检测方法 　　肉眼观察：主要观察鱼类外观症状如长短、粗细、体形，体表及鳍条有否破溃、附着物、缺损、充出血、肿块；鳃盖有否肿大，肛门是否红肿等。解剖检查：将鱼置于白搪瓷盘中从排泄孔处解剖，检查各脏器；打开鳃盖，检查鳃部。显微镜检查：体表刮取少量粘液置于载玻片上，加滴蒸馏水，盖上盖玻片制成水封片于显微镜下镜检；用剪刀剪取部分鳃丝做成水封片镜检；剪开肠管，刮取前中后肠壁上的粘液和内容物做成水封片镜检；剪取少量后。肾组织做成水封片镜检。细菌培养纯化和药物敏感试验：在无菌状态下剪取病鳗体组织，接种于选择性细菌培养基上(如糊精品红培养基、RS培养基、AOA培养基)，适当温度下培养并纯化，用于药物敏感试验。 　　 　　1.3快速检测手段 　　 　　1.3.1血清学凝集反应在一定的电解质存在下，抗原吸附其相应抗体而发生凝集块的过程。多种凝集技术已应用于鱼类的细菌病诊断。凝集反应的灵敏度虽然低一些，但速度快，几小时即可获得结果，不仅适用于实验室，也可用于养殖场实地诊断。以(Yoshimizu pokimura，1985)协同凝集反应技术为例：①配制抗体致敏葡萄球菌(sensitizel staphylococuil)；②取病鱼肝、肾或病灶组织，加4 9滴PBS液，匀浆；③经4000r／min离心后，取上清液；④在玻片上加1滴组织上清液，1滴抗体致敏的葡萄球菌悬液，混匀后置于湿盒内反应30－90min；⑤肉眼或低倍显微镜检查结果，凝集反应阳性则表示组织内含有抗体相应的病原。 　　 　　1.3.2免疫荧光抗体技术采用荧光色素标记免疫球蛋白，抗体与荧光色素经化学偶合后，仍然保持其免疫学反应特性，荧光标记的抗体，能鉴定组织涂片的病原体，不需从病鱼中分离病原。以Rogers 1981年鉴别E.i ctaluri为例，简述其方法：①从病鱼肝、肾或病灶取一小块组织，在玻片上涂片，晾干，60℃微热固定；②加几滴免抗E.ictaluri血清于玻片上，于室温5min，最好放置在一避光潮湿的容器内；③用PH7.2磷酸盐缓冲液(PBＳ)冲洗；④加几滴异硫氰酸荧光素标记的羊抗免IgG放置5min；⑤用PBS冲洗、晾干；⑥加1滴封闭液，覆上盖玻片，在荧光显微镜下检查。如在涂片的不同部位，显现苹果绿颜色荧光即表示存在E.ictaluri病原。 　　 　　1.3.3免疫酶标吸附试验(ELISA)方法与荧光标记抗体诊断法类似，采用酶标记抗体作为示踪抗体。酶联免疫吸附检测方法：多采用13cm8cm的96孔微量酶标板，它可检测鱼体组织内的病原体，亦可检测其血清中相应的抗体水平，以推断鱼体是否感染过病原菌。以Adams等(1990)诊断A.salmonicida为例，简述该方法：①加100mu;1抗A.salmonicida血清缓冲液(每毫升缓冲液含5mu;g免疫球蛋白)到板孔内，塑料薄膜密封后放置过夜；②取出病鱼的肝脏，肾或病灶组织，加8倍磷酸缓冲液匀浆，取上清液；⑧加100mu;1 0.25％酪蛋白封闭液到各孔，置1h；④倒去封闭液用吐温磷酸缓冲液冲洗2次；⑤加100mu;l组织上清液(含病原菌抗原)到检测孔，设阳性与阴性对照，亦可稀释抗原作抗原定量分析，薄膜密封后置lh；⑥倒去孔内溶液，用PBSTu;1酶标记的抗A.salmonicida免疫球蛋白缓冲液(1：1000稀释在磷酸缓冲液)，薄膜密封后在室温下置1h；⑧倒去孔内溶液，用PBS Tu;1显色液置20 60min或显示合适的颜色为止，加100mu;10.4m01／1NaOH停止显色，比较检测孔和对照孔，记录结果即可。 　　 　　1.3.4 PCR,快速检测技术DNA链扩增反应(Polymerase ChainReaction，PCR)是八十年代末发展起来的一项极具应用潜力技术，已经广泛应用于分子生物学研究以及病原的检测和疾病诊断。其原理是根据已知的病原微生物核酸序列设计出一对特异引物，在含有DN