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* * 交联反应前可先用可逆抑制剂或底物进行专一性掩护，或加入惰性蛋白保护。 * 由于交联形成的固定化酶颗粒一般很小，且机械性能不好，可先将酶吸附于载体上或包埋于胶内或微囊内，然后再交联 * 聚合反应过程中由于自由基的产生，放热，以及酶和试剂间可能发生化学反应，会导致酶失活。 * 包埋法优点： 一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高 可进行大量的固定化；包埋膜可选用生物相容材料，并可做成任意大小 包埋法缺点： 在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活 包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，不适用于柱系统 * 图10-1 固定化酶的模式 （a）离子结合；（b）共价结合；（c）交联；（d）聚合物包埋； （e）疏水相互作用；（f）脂质体包埋；（g）微胶囊； * 表 酶的各种固定固定化方法比较 固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 制备难易 易 易 难 较难 较难 结合程度 弱 中等 强 强 强 酶活回收率 高，但酶易流失 高 低 中等 高 对底物专一性 不变 不变 可变 可变 不变 再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能 固定化费用 低 低 高 中等 低 * 第三节 固定化酶的形状与性质 一、固定化酶的形状 （1）颗粒状 （2）纤维状 （3）膜状固定化酶 （4）管状固定化酶 一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连续流搅拌桶式反应器和填充式反应器类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于连续流搅拌桶式反应器，而适用于填充式反应器。 * 二、固定化酶的性质 * 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应 （一）影响固定化酶（细胞）性质的因素 酶经过固定化后引起的性质改变的原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。 载体物化性质和固定化过程影响主要存在三种影响效应： * 1、分配效应 微环境是在固定化酶附近的局部环境。宏观环境指主体溶液。 由底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。 * 2、空间障碍效应 固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。 * * （二）固定化酶性质的改变 1.活力变化 固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： ? 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 ? 固定化后的空间障碍效应的影响。 ? 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。 * 2.固定化后酶稳定性变化 酶稳定性包括其对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。酶固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。 稳定性提高的原因： ? 固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子 伸展变形。 ? 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作 用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起 作用。 ? 抑制自降解，提高了酶稳定性。 * ① 操作稳定性：常用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。 ② 贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。 ③ 热稳定性： 氨基酰化酶：天然酶70oC15min，活力几乎全部丧失，固定于DEAE-纤维素的固定化酶，可以保存60%活力，固定于DEAE-葡聚糖，可以保存80%活力。 * ④ 对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。 例如：氨基酰化酶，天然酶在胰蛋白酶做用下，活力保存23%，固定于DEAE-纤维素的固定化酶，可以保存33%活力，固定于DEAE-葡聚糖，可以保存87%活力。 ⑤对变性剂、抑制剂的抵抗能力 * 3.固定化酶的作用pH变化 酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。 曲线偏离的原因是微环境表面电荷性质对酶活力的影响。因为带负电荷的载体吸附阳离子，使固定化酶扩散层H+浓度高，外部溶液的pH必须向碱性偏移才能抵消微环境的作用，使酶表现最大活力。 * 4.固定化