基因的克隆.pptVIP

Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型载体----pGEX系列 * （二）非融合型表达载体 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 * 主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子 * 非融合型表达载体----pPL-Lamda PL启动子---温度诱导 插入位点--HpaI * （三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 * 分泌型表达载体----pINIII-ompA1 * 分泌型融合表达载体----pEZZ18 * 六．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子----提高转录水平 核糖体结合位点（ATG---SD） 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂 * 2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌 * 3、诱导表达 温度诱导------PLPR / IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解 * 七．表达产物的检测： 1、特异性鉴定： 荧光抗体法 免疫沉淀法 免疫印迹法 ELISA 2、生物学活性鉴定 * 八、原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工 * 真核表达系统的必要性及优势 1. 具转录后加工系统 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 4.基因治疗 * 真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列 ---mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体---表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构 * (二）真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式 * 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 * （三）转化 1、原生质体法：去除厚壁 2、电穿孔法：效率较高 * （四）外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列 * （五）缺点 不能实现全部的翻译后修饰功能 * 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况 * 3、构建cDNA文库，筛选目的基因 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 * cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选 * 4、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法 * 5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因 * （二）体外重组 连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18℃ 平末端连接：室温（低于30℃) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3 酶量：平端连接时需加大酶量 * （三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交 2、鉴定： 长度鉴定：酶切、PCR 方向鉴定：联合酶切 测序 * 基因的表达 Gene Expression * 一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 * * 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 * 二．原核生物基因结构和表达特点 * 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程