基因工程11-大肠杆菌基.pptVIP

施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高 * 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子 使用可控型复制子 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 * E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 * 胰岛素的结构及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（30） C 肽（31） A 肽（21） R R R K S S S S C N S S N C 高尔基体内的特异性肽酶 N C 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 * 人胰岛素的生产方法 直接提取法制人胰岛素 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： 早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。 * 人胰岛素的生产方法 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但生产成本奇高，限制了广泛应用。 * 人胰岛素的生产方法 化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。 技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%。但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。 * 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。 * 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链分别表达法 基因工程菌的构建战略： tac tac b-Gal b-Gal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化学合成A链 和B链的编码 序列 * 表达产物的后处理路线： M M N C M M N C b-Gal b-Gal A B CNBr 处理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 体外氧化和重折叠 分离纯化 * A链和B链分别表达法 生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。 * 第二种基因工程菌的构建战略： tac b-Gal C peptide ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 人胰岛素原cDNA 重组人胰岛素原 转化 分离纯化 * 表达产物的后处理路线： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶B B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感 * 生产技术的评价： 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 * A链和B链同时表达法 tac b-Gal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化学合成AB链编码序列 重组人胰岛素 转化 分离纯化 CN