基因工程3大肠杆菌表.pptVIP

造成密码子使用的偏爱性的两个原因： 1）细胞中同工tRNA的丰度差异； 2）嘧啶碱基结尾的密码子（C或U）之间的非随机选择。实验发现，密码子第3位结尾的嘧啶碱基在使用上是非随机的，存在着偏爱性，且这种偏爱性与基因的表现度有关。对于具高表达活性的基因，如果密码子的头两个碱基是AA或UU，则其第三位碱基偏向选用C，而如果头两个碱基是GG或CC，则其第三个碱基偏向选用U。 3） 碱基含量（AT/GC） * （2）密码子使用的偏爱性对基因表达效率的影响 ** 富含大肠杆菌罕见密码子的外源真核基因是很难在大肠杆菌细胞中得到有效的表达。反之，则表达效率提高。 ** 到底多少含量的罕见密码子才不会给克隆在大肠杆菌的外源基因的表达造成负面影响？ 机制还不明确。 * 5、寄主细胞的生理状态对基因表达的影响 大肠杆菌的生理状态会或多或少地影响外源基因的表达效率；但究竟是怎样影响外源基因的表达效率，仍缺乏全面系统的研究。 影响大肠杆菌生理状态的因素：包括培养基营养成分、细胞培养方式、以及培养温度和培养基中所溶解的氧等。 * * 容易出现转录过头，影响表达效率。需要使用强的转录终止子。 * 5‘端的“茎环”结构可能影响mRNA与核糖体30S亚基的结合 * 在细胞周质或胞外表达转运过程中N端信号肽被切除，不带有甲硫氨酸（ATG） 三、大肠杆菌的转化方法 1、Cohen转化法 1972年Cohen改进而成，是目前最常用的方法。 操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生； （3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒； （4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因； （5）选择培养基培养，选择转化体。 * 2、Hanahan转化法 1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。 这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使转化效率提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。 值得注意的是：此法要求的条件高，对外界污染物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极少数情况下才使用此法。 * 3、电转化法 * 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和DNA浓度等参数的影响。 转化效率：108-109转化体/μg DNA。 ? 当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致50%-70%细菌死亡时，转化效率达到最高。 * ? 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重悬细胞，使其浓度为3?1010细胞/毫升，在干冰或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。 ? 转化必须在0-4 ℃下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。 * 四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 1、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 * 克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位： 细胞质；细胞周质；分泌到细胞外 这三种表达部位各有不同的优缺点，而且对表达量和表达产物的制备有很大关系。 * 在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点 表达部位 优点 缺点 细胞质 1、 形成包涵体 1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性 （1）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 2、还原的环境不利于二硫键的形成 （2）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解 （3）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害 2、表达的质粒载体构建比较简单 周质