大蒜辣素致肝癌细胞HepG2凋亡研究.docVIP

　　大蒜辣素致肝癌细胞HepG2凋亡研究 作者：燕丹 王坚 袁燿佐 陈志强 【摘要】 目的研究大蒜辣素（Allicin）导致肝癌细胞HepG2凋亡的现象及其影响 规律 。方法运用CCK－8试剂盒研究Allicin对HepG2细胞增殖的影响，运用流式细胞仪检测其对细胞凋亡、DNA代谢的影响，运用免疫印迹（ethodsCCK-8 etry machine ortality rate, finally ethod ental results shoental results indicated that the DNA metabolism ost of them itosis ore Allicin can cause cell DNA metabolism disturbance.EM培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)购自美国Sigma公司，青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品，大蒜辣素由江苏省药品检验所提供。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品，试剂盒编号EM培养基，细胞种植到细胞培养瓶后放置在5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，用磷酸盐缓冲液(PBS)在1 500 r/min离心转速下离心洗涤两次，用含10％FBS DMEM培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105 cells/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存时其浓度应高于106 cells/ml。 　　2.2 大蒜辣素溶液的制备通过色谱条件优化，建立了高效液相制备色谱的色谱条件：C18色谱柱（18 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（70:30），检测波长240 nm，全自动组分收集器收集相应的组分，得高纯度的大蒜辣素溶液（纯度大于99.0%）。大蒜辣素含量测定方法按《欧洲药典》5.0收载的“garlic pol，孵育时间为24 h，孵育完成后进行检测。 　　2.4 细胞增殖实验运用CCK-8试剂盒检测细胞增殖速率，最后结果绘成生长曲线。实验方法按试剂盒提供实验方法进行［7］。首先制备细胞悬液，依照次序对应分别加入96孔板中;接种细胞数量为1 000 cells/孔，培养基体积100 μl/孔，37℃孵箱中培养2～4 h，加入不同浓度的大蒜辣素，分别标记样品编号，继续放入37℃孵箱中培养2 h，加入10 μl CCK-8于样品孔中，37℃孵箱中培养2 h后，每孔加10 μl 0.1mol/L HCl终止显色反应。吸光度测试所用入射光波长为450 nm。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。 　　2.5 细胞凋亡及周期检测细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成。凋亡实验按试剂盒所示方法进行，首先将Allicin孵育后细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤两次并将细胞浓度重悬浓度调整为106 cells/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液，然后用Annexin-V加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，准备上机实验。流式细胞仪机上实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。细胞周期实验方法按试剂盒所述方法进行，首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A、B、C、D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15min。染色完成后上机实验。 　　2.6 免疫印迹（l时细胞增殖抑制与之呈正相关性随着加入浓度的提高其 抑制率可达到70%，加入浓度超过120 μg/ml后抑制效果未增强与120 μg/ml时比较未出现明显增强。 　　3.2 细胞凋亡死亡及细胞周期实验结果细胞凋亡实验结果见图2及表1；周期检测实验结果见图3及表2。由于Allicin的加入导致癌细胞发生凋亡，在低Allicin加入浓度时细胞的凋亡率随其加入浓度的提高而增加，但浓度达到120 μg/ml时细胞凋亡率达到最大值4.13%，超过此浓度后与120 μg/ml浓度结果相比较未发生明显的变化。同时实验结果表明Allicin也能导致细胞大量死亡，其最高死亡率达到70.31%，其变化规律与凋亡变化规律类似。 　　3.3 ole Plant Path,2004, 65(2): 79. 　　［4］ Oommen S, John A R, Srinivas G, et al, Allicin (from garlic) induces caspase-mediated apoptosis in can