大豆菌核病生防菌克Ｈ３菌株发酵条件研究.docVIP

　　大豆菌核病生防菌克Ｈ３菌株发酵条件研究 　　摘要：通过对大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基，最适温度35℃，适宜pH值7.0～8.5，最佳发酵时间48h，克H3生长曲线表明，6～18h为该菌延迟期，18～30h为对数生长期，30～54h为稳定期，54h后进入衰退期。 　　关键词：大豆菌核病；克H3；发酵条件 　　 　　1材料与方法 　　 　　1．1　供试培养基 　　①PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。②高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO3·7H2O0.5g，Fe-SO40.01g，水1000mL。③肉汁蛋白胨培养基：牛肉膏5g，NaCl5g，蛋白胨10g，水1000mL。④玉米粉培养基：玉米粉300g，水1000mL。⑤YPG培养基：酵母浸膏8g，酵母膏2g，KH2PO40.5g，K2HPO42g，水1000mL。灭菌后加入无菌10％葡萄糖50mL和1MMgSO4·7H2O1mL，pH值7.2。⑥BPY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL。pH值7.2。⑦自制培养基：豆粉10g，葡萄糖10g，酵母膏5g，水1000mL。 　　 　　1．2主要仪器设备 　　HYA恒温摇床( 中国 科学 院武汉仪器厂)，O-lympus显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，PHS-3C型酸度计(金坛市泰纳仪器厂)，电热恒温培养箱(南京电器三厂)，手提式高压灭菌锅(哈尔滨东联 电子 公司)，超净工作台(上海精密仪器仪表厂)。 　　 　　1．3试验方法 　　 　　1·3．1克H3菌株发酵液的制备 　　将活化的克H3菌株用接菌环划线接种于肉汁蛋白胨培养基斜面上，30℃恒温培养2d后，每试管用5mL无菌水配成克H3悬浮液，将5mL的克H3悬浮液置于装有100mLPDA培养液的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中培养48h制成发酵液。 　　1．3．2抑菌活性的测定方法 　　采用滤纸片法。在PDA培养基一侧放人直径8ram的已灭菌的圆形滤纸碟片，用移液枪接种克H3悬浮液5μL，另一侧放人核盘菌(6mm)，菌间相距3cm。每处理3次重复，5d观察拮抗效果，测量抑菌带宽度。 　　1．3．3最佳培养基的选择 　　供试培养基为PDA培养基、高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、玉米粉培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基，将5mL的克H3发酵液分别置于装有100mL上述培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。 　　1．3．4培养温度的测定 　　处理温度为20～40℃，梯度为5℃，将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。 　　1．3．5起始pH值的测定 　　用PHS-3C型酸度计将自制培养基中的pH值调节为5.5～10，间隔为0.5。将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性，每处理3次重复。 　　1．3．6培养时间的确定 　　将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养。每间隔12h取发酵液测定抑菌活性，至72h结束，共取样6次。 　　1．3．7培养基装液量的确定 　　在250mL三角瓶中分别装入25、50、75、100、125、150mL的自制培养基，接种5％的克H3发酵液，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。 　　1．3．8接种量的确定 　　分别按1、2、5、7、10、20、30mL接种量接人100mL自制培养基中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵产物测定抑菌活性。 　　1．3．9摇床转速的确定 　　250mL三角瓶中装入自制培养基100mL，接种5mL克H3发酵液后，分别在160、180、200、220r/min摇床中35℃震荡培养48h后，取发酵液产物测定抑菌活性。 　　1．3．10克H3菌株生长曲线 　　在250mL三角瓶中装入100mL自制培养基，加入克H3发酵液5mL，在最适温度、最适pH值下180r/min恒温振荡培养后，以6h为时间间隔取样，即6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h分别取样，稀释平板法测定每毫升菌落个数。 　　 　　2结果与分析