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疾病诊断新方法 中国医科大学医学遗传学教研室 金春莲 DNA为基础的疾病诊断新方法 飞速进展的原因 分子生物学新成就 1.人类基因组计划完成. 2.很多疾病基因的定位,克隆,鉴定. 3.功能基因组学研究的深入 分子病因搞清楚----动态突变、早现遗传、非孟德尔遗传现象等. 分子生物学新技术 DNA、RNA、蛋白检测新技术 1. DNA重组技术,分子杂交技术. 2. PCR技术----PCR-RFLP,PCR- SSCP,PCR-DGGE. 3. DNA自动测序. 4. DNA芯片技术. 电子计算机的广泛应用  DNA为基础的诊断领域 检测基因结构（ DNA ），基因功能表达（RNA、蛋白质）判断是否存在基因缺陷，是分子水平的病因诊断。 患者DNA诊断性检测 a、不受被检材料来源的影响 b、晚发性遗传病的症状前诊断成为可能 c、分子水平阐明遗传异质性（基因座异质性、等位基因异质性） 应用这些特征可进行产前基因诊断 (1)基因检测必须要有针对目标----特定基因 (2)直接检测特定基因的突变----位点、性质 (3)基因示踪----连锁分析 受检材料的选择：DNA，RNA或蛋白质 DNA检测样品： 血液---最广泛采用的成人DNA来源 漱口液或颊膜刮片---群体筛查 绒毛膜绒毛活组织---产前诊断 羊膜腔穿刺取羊水---产前诊断 毛发，精液---法医 归档的病理学标本---肿瘤研究 Guthrie卡片---新生儿筛查及样品保存 取自8个细胞期胚胎的1--2个细胞---植入前诊断 RNA优于DNA，但更难于获得与操作 1、目的基因易于获得组织中表达 2、较大基因未知突变筛查 3、RT-PCR和DNA测序相结合可检出DNA水平的突变，而且能可靠地检测出hn-RNA加工过程的异常剪接。 RNA检测时要注意的一些问题：①避免mRNA的降解②目的基因的表达组织③许多突变导致mRNA不稳定，因此杂和个体的RT-PCR产物可能只显示正常等位基因 。 蛋白质表达分析---检测特异蛋白质 免疫印迹（Western blot）免疫组织化学 免疫荧光技术 蛋白质截断试验（protein truncation test,PTT） 一种特异性的检测方法，用于检测移码突变、剪接位点突变或产生提前终止密码子的无义突变。 蛋白质功能测定在遗传检测中发挥作用 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 二、基因检测基本原理及常用技术 1.核酸分子杂交 双链DNA 变性 单链 复性 杂种DNA 加热,强酸, 探针 强碱,变性剂 探针----一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列,作为工作状态的探针必须是单链. 常用探针种类----基因组DNA,cDNA,人工合成的寡核苷酸. 探针标记 放射性同位素标记法-----缺口平移法,末端标记法,随机引物标记法. 非放射性标记法-----地高辛标记,生物素标记,辣根过氧化物酶标记等. (1)斑点杂交(Dot blotting hybridization) 主要应用于基因缺失,和拷贝数改变 ASO探针----检测已知点突变. (2)Southern印迹杂交 1975年Edward Southern建立的检测DNA技术. 基因组DNA 限制酶消化 凝胶电泳分离 变性 转移到 硝酸纤维素膜(尼龙膜) 固定 预杂交 探针 杂交 洗膜 放射自显影 分析 杂交片段的大小及密度. 能推测: 1. DNA片段的缺失,插入,重排等. 2. 改变限制酶酶切位点的点突变. 3. DNA扩增等拷贝数改变. 4. RFLP等多态性. (3)Northern 印迹杂交 检测RNA的分子杂交技术 提取组织总RNA oligodT mRNA 含甲醛