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Chapter 03 基因工程工具酶;§3.1 限制性内切酶 §3.2 DNA 聚合酶 §3.3 其他分子克隆工具酶 ;3.1限制性内切酶(Restriction Endonuclease);3.1.2 限制性核酸内切酶的概念 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;① 第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus) ② 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species) ③ 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain) ④ 罗马字母表示发现和分离的先后顺序;限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶; Ⅱ 型（type Ⅱ）： 限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体， 93% Ⅰ 型（type Ⅰ）： 限制酶、甲基化酶识别 DNA 序列的 S 亚基 ， 1% Ⅲ 型（type Ⅲ）：不到 1% ;3.1.5 限制酶识别的序列 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;限制酶识别序列的结构 ;3.1.5.3 酶切位点;3.1.6 限制酶产生的末端;;;;Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆1个单位限制性核酸内切酶;3.1.7.1 缓冲液 常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值（7.0-7.9 ）的缓冲剂、 Mg++ 、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA。 3.1.7.2 反应温度 大多数为 37℃;3.1.7.3 反应时间??? 反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。 3.1.7.4 终止酶切的方法 EDTA 加热;① DNA样品的纯度 ② DNA样品的甲基化程度 ③ 酶切反应的温度 ④ DNA分子结构（底物构象） ⑤ 核酸内切酶的缓冲液;Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的???异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。;星星活性产生的原因如下： ① 反应体系中甘油的浓度过高 ② 酶用量过大 ③ 低离子强度 ④ 高pH ⑤ 含有机溶剂 ⑥ 非Mg2+的二价离子的存在。;① 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段 ② 建立DNA分子的限制酶图谱 ③ 构建基因文库 ④ 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组 ⑤ 改建质粒; ① 每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10% ② 整个操作应在0℃进行，最后加入酶 ③ 切割大量DNA时，延长反应时间，减少酶的用量 ④ 应用通用缓冲液;3.2 DNA 聚合酶 (DNA polymerase);Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;3.2.1.2 E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;3.2.2 Klenow DNA 聚合酶 （1）Klenow酶