人粒细胞无形体病实验室检测方案_百替生物.pdfVIP

人粒细胞无形体病实验室检测方案 （试行） 为保证及时、科学地采集、运送人粒细胞无形体病病例（包括 疑似病例）及疫源地调查的各种类型标本，规范人粒细胞无形体病 的实验室检测程序，提高检测质量，为明确诊断或开展相关的科学 研究提供实验室依据，特制定本方案。 一、样本采集对象 （一） 人粒细胞无形体病病例（包括疑似病例，以下同）。 （二） 病例密切接触者或其他健康人群。 （三） 疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛等家畜）、 媒介蜱。 二、标本种类及采集方法 （一） 抗凝血。 常用 EDTA 抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液 5ml，用于病原分 离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。 （二）非抗凝血。 用无菌真空管，采集病例、健康人群及宿主动物非抗凝血 5ml， 用于血清抗体及 PCR 检测。采集后，应及时分离血清，将血清、血 球分别保存。急性期抗体及 PCR 检测用血液采集尽可能在发病后 1 周内，恢复期抗体检测标本采集至少间隔 2-3 周。如第 2 份血清在 1 个月之内抗体升高不明显的，应建议间隔 2-4 周后采集第 3 份血 service@100 液标本。 （三）包涵体检测血涂片的制备。 采集血液标本后，制作厚血片，进行红细胞裂解处理等。 （四）媒介蜱标本的采集。 采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤纸或纱 布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。实验室 接到蜱标本后，首先应进行种属鉴定，然后按类别分组（1-5 只蜱/ 组），采用 75%酒精浸泡 30min 后，用无菌蒸馏水反复冲洗 3 次。最 后进行分组研磨，研磨液用于提取 DNA，进行PCR 扩增。 （五）有条件时，可采集活检或尸检标本，冰冻、福尔马林固 定或石蜡包埋后进行实验室检测。具体方法参照病理实验室相关要 求和卫生部《传染病人或疑似传染病人尸体解剖查验规定》的相关 要求。 三、标本采集和保存注意事项 标本采集应符合无菌操作要求。抗凝血如不能立即床边接种， 应置于 4℃环境保存，避免冰冻（不超过 2 周）。非抗凝血应及时进 行无菌分离血清，血清用于抗体检测，血球部分研磨后提取 DNA 用 于 PCR 检测。如不能及时检测，可暂置于－20℃环境保存。所有标 本应置入大小适合、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，拧紧管口。 标本采集后，应认真填写采样登记表。 四、实验室检测 （一）包涵体的检测。 service@100 1. 血片及白细胞涂片制备 采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片，待干燥后冷丙酮固定 10min；或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片，待干燥后冷丙酮固 定 10min。 2. 染色 通常采用瑞氏（Wright ）染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞－ 姬混合染色法。有条件的实验室，可使用美国 CDC 推荐的染色方法。 3. 染液配置方法 （1 ）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研 溶，加甲醇 500ml 保存，每天摇匀１次，１周后可使用。 （2 ）改良Mc Donald 法瑞－姬染色剂：75 ml 甘油（分析纯） 中加入磷酸盐缓冲液（Na HPO 1g 和 KH PO 2g ），以4 ml 蒸馏水溶 2 4 2 4 解，37 ℃水浴 24 h 溶解混匀，用滤纸过滤，保存于密封的棕色瓶 中备用。上述甘油缓冲液 1.5 ml 加瑞－姬染色剂 50 ml，混匀后备 用。 4. 染色步骤 血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色 2 min，再加蒸馏 水作用 5 min，用自来水冲洗。 5. 结果观察 中性粒细胞中可见桑葚状包涵体（见图 1 ），并注意保存相关标 本，以便进行复核。 （二）血清学检测。