分光光度技术2012830_18000613.ppt

6 分光光度技术 6.1 基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术。 使用的仪器称为分光光度计。 其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。 吸收光谱中，λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。 2. 光吸收定律： 朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律： A＝－lgT＝εb c A——吸光度，又称光密度“O.D”。 T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到 吸收池上的光强，I——为透过吸收池的 光强。 ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数 （L·mol－1·cm－1）。 b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸 收池，b=1cm。 c——样品浓度（mol/L）。 由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε” 和物质的浓度“c”成正比。 摩尔吸光系数ε ： ε=A/bc ， 是物质对某波长的光的吸收能力的量度。 ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高，ε值大，说明电子跃迁的几率大。 通常 ε＝10～105： 一般认为： ε＞ 104为强吸收； ε＝103～104 为较强吸收； ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度 A＝0.001, 所以，当 b＝1cm, ε＝105 时，可检测的溶液最小浓度是 C＝10-8 mol/L。 常用的吸光系数还有一种百分吸光系数， 即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V）， 液层厚度 b＝1cm 时的吸光度，以 E1%λmax 表示。 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋…… 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 分光光度计的组成和构造： 组成： 各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。 ? 光源 单色器 样品室 检测放大系统 显示器 我系2000年购买的德国耶拿（蔡司）公司生产的SPECORD 200型高档紫外/可见光分光光度计.如下图： SPECORD 200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的带温控的光电二极管检测器，即为“双检测器”，其波长范围是190nm～1100nm，吸光度测定范围是0～3A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。 构造： ⑴ 光源： 理想光源的条件是： ①能提供连续的辐射； ②光强度足够大； ③在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化； ④光谱范围宽； ⑤使用寿命长，价格低。 用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是320～1100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。 用于紫外光区的是氘灯（Deuterium la