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第20章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广 1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。 上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。 现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪要复杂和昂贵。 现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。 通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。 目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。 1.往复柱塞泵 2. 其他类型泵 气动放大泵又称为恒压泵，其工作原理与水压机相似，以低压气体作用在大面积气缸活塞上，压力传递到小面积液缸活塞，利用压力放大获得高压。 螺旋注射泵又称为排代泵，其结构类似于医用注射器，由一个大体积液体室和柱塞组成，步进电机通过螺旋杆传动机构推动柱塞输出高压液体。 3.流速控制和程序系统 比例调节阀和混合器；脉动阻尼器；放空阀；过滤器；反压控制传感器等。 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。 1.色谱柱类型 4. 柱填充技术 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质