知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究.docVIP

　　知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究 【摘要】 目的：观察知母宁的抗乙肝病毒作用。 方法 ：观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及对乙肝模型鸭DHBV-DNA的 影响 。结果：知母宁浓度为4 mg/mL时对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用；以200 mg/kg 治疗 乙肝模型鸭10 d后DHBV-DNA水平明显降低。结论：知母宁有抗乙肝病毒的作用，其机制可能与抑制HBV-DNA的复制有关。 【关键词】 知母宁 乙肝病毒 2.2.15细胞 DHBV-DNA Abstract Objective：To study the effect of Chinonin on HBV in vivo and in vitro. Methods： The level of HBsAg and HBeAg secreted from HepG2.2.15 cells and the copies of DNA of duck hepatitis B virus（DHBV）models g/mL in vitro. In vivo，chinonin can decreased significantly DHBV level of duck model after 10 days treatment g/kg. Conclusion：Chinonin has the effect of decreasing the secretion of HBeAg，aybe relate to restraining the duplication of HBV-DNA. Key ega公司生产）；α-32P-dCTP（北京亚辉公司生产）；DHBV阳性血清。 1.1.3 实验仪器 细胞培养瓶、96EM培养基培养于细胞瓶中，长满后，用0.06%的胰蛋白酶消化2 min~3 min，弃消化液，加少量DMEM培养液轻轻吹打，制成3×105/mL单个细胞悬液，种于96孔细胞培养板中，每孔0.1 mL，37 ℃，5% CO2，48 h，细胞贴壁后用于实验。 1.2.2 HBeAg和HBsAg测定 将Chinonin配成多个浓度（从16 mg/mL浓度开始倍比稀释），加于已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中，0.1 mL/孔，每浓度4孔；设无药细胞对照组4孔及空白对照组4孔，每孔加入0.1 mL 2%DMEM。加药培养10 d后，吸取培养液于另一96孔板中，即行HBeAg和HBsAg测定，用酶标仪以450 nm波长测定OD值（了解抗原的分泌情况）。原96孔板中用MTT染色，每孔加0.4 g/L MTT 0.1 mL，37 ℃，5% CO2孵育4 h，弃上清后加DMSO 0.1 mL溶解，然后以490 nm波长比色测定OD值（了解细胞存活情况）。 1.2.3 鸭乙肝模型的建立及给药 1 d龄华南麻鸭，足静脉注射DHBV阳性血清，每只0.2 mL，1 g/kg灌胃）、Chinonin低剂量组（100 mg/kg灌胃）。 1.2.4 DHBV-DNA检测 分别在给药前及给药后5 d、10 d，停药后3 d，用斑点杂交法检测DHBV-DNA。（1）探针的标记：DHBV-DNA探针标记采用缺口平移法，按Promego药盒说明书稍加改动进行。（2）斑点杂交：①点样：将硝酸纤维素膜用去离子水和10×SSC溶液各浸泡30 min，室温晾干后点膜，40 μL/样，真空抽滤；②变性：将膜分别置于变性液I 10 min，变性液II 10 min，变性液III 10 min，将变性后的膜室温晾干，置80 ℃烤箱中2 h，烤干；③预杂交：将膜置3×SSC-0.1%SDS 10 mL中，65 ℃，30 min，换10×Dendhart-0.1% SDS 10 mL中，65 ℃，4 h或过夜；④杂交：弃预杂交液，于杂交袋中加入杂交液，封口后42 ℃，36 h~48 h；⑤洗膜，用医用X线胶片，-70 ℃ 感光5 d后显影、定影。 1.2.5 计算 公式及统计方法数据结果以（x±s）表示，组间均数比较采用t检验，以SPSS9.0统计软件处理，显著性水平α=0.05。 2 结 果 2.1 Chinonin对细胞的毒性作用 结果见表1。由表1可见，Chinonin浓度在16 mg/mL、8 mg/mL时对细胞的毒性较大，破坏率均＞50％，而4 mg/mL时毒性明显减弱，破坏率为24.03％，且破坏率随浓度的下降而下降。经计算，Chinonin的半数毒性浓度（TC50）为6.318。为排除药物对HBeAg 、HBsAg的抑制作用是由于对细胞的毒性所致，故选择TC50以下的浓度来评价药效。当Chinonin浓度为4