绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究.docVIP

　　绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究 作者：王元忠，刘鸿高，张金渝，李涛 【摘要】 目的建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法反相高效液相色谱（RP-HPLC） Plasil C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（15∶85），流速为1.0 ml·min-1，检测波长为261 nm，柱温为室温。对绒柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）进行指纹图谱定性分析，对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。结果在色谱条件下，11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP-HPLC指纹图谱中可检出11个相对稳定的色谱峰，其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰；绒柄牛肝菌中腺苷的含量为0.146%～0.493%。结论绒柄牛肝菌有效部位RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性，可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质量控制。 【关键词】 绒柄牛肝菌； 腺苷； 指纹图谱； 反相高效液相色谱 绒柄牛肝菌Boletus tomentipes Earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛脚牛肝菌，属于担子菌亚门（Basidiomyctina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricase）、牛肝菌科（Boletaceae）中的一种［1］。我国主要分布于云南，生于针阔叶林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌属约有1 024种或变种，我国已知的可食用的就有199种［2］。据 　　2.2.3 仪器精密度和对照品溶液稳定性实验精密吸取腺苷对照品溶液，在上述条件分别进样6次， 计算 腺苷的峰面积，RSD＝0.678％，表明仪器精密度良好。 　　精密吸取腺苷对照品溶液，于配制后的0，2，4，8，14，26，48 h测定，其峰面积RSD＝1.04％，表明腺苷对照品溶液在48 h内稳定。 　　2.2.4 样品溶液的稳定性实验取同一批号的样品，分别在0，2，4，8，14，26，48 h检测指纹图谱，各色谱峰的相对保留时间无明显变化，单峰面积占总峰面积5％以上的色谱峰与参照峰的峰面积比值也无显著变化。RSD＝1.454％，表明样品溶液在48 h内稳定；仪器精密度可靠，符合指纹图谱要求（国家药监局，2000）。 　　2.3 指纹图谱的建立分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，记录60 min色谱图即得。比较11批供试品的HPLC图谱发现，其中有6个色谱峰是11批供试品所共有的。计算图谱中各共有峰色谱峰相对于腺苷色谱峰（3号峰）的相对保留时间（a=ti/t8）和相对峰面积值（AR=Ai/A总×100%）。结果见表2～3。表2 不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较（略）表3 不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较（略） 　　2.4 共有峰确定在11份绒柄牛肝菌供试样品的HPLC图谱中，由色谱峰相对保留时间（a）的稳定性（相对偏差小于3%），可以确定的共有峰有9个，其相对保留时间从0.108 ～ 2.180；同时分别计算11个样本主要峰的总面积（A总）、平均总面积（a总）以及总面积的相对偏差，舍去总面积相对偏差小于-40%的（样品编号为3，4，10），最后其余样本确定绒布牛肝菌共有峰1，3，5，6，7，8，9，10，11号峰，作为绒柄牛肝菌指纹图谱定性分析的指标峰。用此定性指标鉴定11样本，结果所有样本均为绒柄牛肝菌。 　　2.5 绒柄牛肝菌中腺苷含量测定按“1.3”方法处理，进样5 μl分析，测得峰面积积分值，计算绒柄牛肝菌中腺苷含量。结果见表4。 　　 3 讨论 　　RP-HPLC法虽然是一种有效的分离分析方法，但由于绒柄牛肝菌成分复杂，性质各异，即使使用梯度洗脱也很难获得理想的分离结果。使用梯度洗脱增加了实验操作和重现性难度，而且难以突出地反映药用真菌与主要药理作用相关的有效成分群，从而在质量控制方面无法有效地做到“纲举目张”。本实验应用反相高效液相色谱技术，建立了以绒柄牛肝菌指纹图谱定性和有效成分定量的分析方法。这种方法是在物质基础上，以绒柄牛肝菌为质控对象，并利用 现代 仪器分析技术同时进行定性和定量分析，增强了方法的有效性和针对性。实验中采用等度洗脱方式，色谱条件容易控制，可保证分析结果的重复性。表4 不同地区绒柄牛肝菌中腺苷含量测定结果（略） 在色谱条件下，绒柄牛肝菌的HPLC图谱中可以检出11个色谱峰。通过对11份绒柄牛肝菌供试样品的HPLC图谱中主要峰相对保留时间（a）分析，其相对误差（RSD）均小于3%，表明主要色谱峰在HPLC图谱中的相对位置是稳定的，可以作为定性鉴别的指标参数；同时，测定各样本主要峰的总面积（A总），以反映在不同样本中的绝对含量，而各总面积的相对偏差则可以