老鼠簕对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究.docVIP

　　老鼠簕对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究 作者：梅燕 林军 侯软玲 刘林 【摘要】 　　目的研究老鼠簕对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGFβ1）与Smad3 mRNA表达的影响。方法）的合成和降解失调。肿瘤坏死因子α（TNF-α）在肝纤维化始动激活及调控中具有重要作用；转化生长因子β1（TGFβ1）是导致肝纤维化的最重要的细胞因子, 其作用的发挥和细胞内信号转导蛋白Smad 密切相关。其中，Smad3是介导TGFβ1诱导肝纤维化的关键分子。本实验观察老鼠簕 治疗 大鼠实验性肝纤维化的疗效，研究大鼠肝组织TNF-α、TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达情况，探讨老鼠簕对大鼠肝纤维化的治疗机制。 　　 1 材料 　　1.1 动物清洁级l-1的药液；取50 g老鼠簕乙醇浸膏，用单蒸水配制成低剂量浓度为0.1 g·ml-1的药液。 -4℃保存备用，使用前摇匀；秋水仙碱（西双版纳股份药业有限责任公司，批号：060717），用单蒸水配制成浓度为0.040 mg·ml-1的药液。 　　1.3 试剂四氯化碳（上海化学试剂公司，批。Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）；RT-PCR逆转录试剂盒（美国Fermentas）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂，批；三氯甲烷（重庆川江化学试剂厂，批，异丙醇（成都市科龙化工试剂厂，批。 　　 2 方法 　　2.1 建立大鼠肝纤维化模型［2］及给药方法60只l·kg-1，以后每周2次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.03 ml·kg-1。空白对照组仅皮下注射等体积植物油。连续8周。在注射四氯化碳4周后，秋水仙碱组以0.4 mg·kg-1、老鼠簕乙醇浸膏高、低剂量组分别以2.0，1.0 g·kg-1，用等容量给药法按10 ml·kg-1灌胃，1次/d。空白对照组和模型对照组给予等容量的生理盐水。连续4周。 　　2.2 标本采集所有大鼠于第8周末处死，取肝左叶组织1块，于-70℃保存。 　　2.3 肝组织TNF-α、TGFβ1 与Smad3 mRNA的表达测定Trizol提取大鼠肝组织总RNA，方法按试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA纯度，按RT-PCR逆转录试剂盒说明把mRNA逆转录成cDNA。RT-PCR分析TNF-α、TGFβ1 与Smad3，β-actin作为内参。TNF-α、TGFβ1 、Smad3和β-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TNF-α上游引物序列：5’TGCCTCAGCCTCTTCTCATT 3’，下游引物序列： 5’TGGTATGAAGTGGCAAATCG 3’，扩增产物长度为404bp；TGFβ1上游引物序列：5’TACAGGGCTTTCGCTTCAGT 3’，下游引物序列： 5’TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3’，扩增产物长度为394bp；Smad3上游引物序列：5’GCAGTGGCAATCACAGAGAA 3’，下游引物序列： 5’AACAGCCTGGGAGAGACTCA 3’，扩增产物长度为386bp；β-actin上游引物序列：5’AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG 3’，下游引物序列： 5’TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT 3’，扩增产物长度为240bp。取5μg总RNA按逆转录试剂盒说明书逆转成cDNA。以cDNA为模板分别按以下条件PCR反应扩增TNFα、TGFβ1 和Smad3片断。TNF-α PCR条件：94℃ 4min 30s，94℃30s，52℃30s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min；TGFβ1 PCR条件：94℃ 4 min 30 s，94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min；Smad3 PCR条件：94℃ 4 min30 s，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 8 min。取5 μl PCR产物，在2%琼脂糖凝胶（含溴乙啶）上电泳，电泳条件：120V，20min，凝胶电泳成像分析系统采集图像。以内参β-actin为基准作半定量分析，以扩增目的基因区带的灰度值与内参β-actin区带的灰度值之比确定各扩增目的基因的相对表达水平。 　　2.4 统计学方法用SPSS13.0软件分析，计量资料用±s表示，多样本均数采用方差分析。P＜0.05表示差异有显著性意义。 　　 3 结果 　　3.1 肝组织总RNA的提取提取的总RNA通过测定OD260/OD280比值均介于1.7～2.0之间，表明各样品RNA纯度符合实验要求。经