茯苓等9种中药植物雌激素活性筛选的实验研究.docVIP

　　茯苓等9种中药植物雌激素活性筛选的实验研究 作者：帕丽达·阿不力孜 热娜·卡斯木 盛萍 丛媛媛， 服部征雄 【摘要】 　　目的对几种中药进行了植物雌激素的活性筛选。方法采用人乳腺癌细胞增殖法与酵母菌雌激素筛检实验法对9种中药进行了植物雌激素活性的研究。结果成功地建立了E-SCREEN法与Yeast Estrogen Screen实验法，此两种方法均可检测到1×10-13 mol/L的雌二醇。在这两种体外雌激素活性筛选实验条件下，当归、泽泻、川芎、牡丹皮、桂枝均有雌激素活性；而茯苓、桃仁则无雌激素样活性。结论E-SCREEN法敏感性高，并有快速、简便等优点，适用于大量化合物的初选。 【关键词】 人乳腺癌细胞增殖法 酵母菌雌激素筛检实验 雌激素活性 　　Abstract：ObjectiveTo evaluate the estrogenic activity of several kinds of Chinese herbal medicines. MethodsE-Screen and Yeast Estrogen Screen technology edicines. ResultsThe tethods detected estradiol at very lool/L. It ae Hikono.,Alisma orientale Juzepczuk.,Cnidium officinale Makino.,Paeonia suffruticosa Andr.,Cinnamomum cassia Blume. had estrogenic effects, .Its suitable for large-scale screening for estrogenicity of environmental chemicals. 　　Key ae Hikono.(日本北海岛);川芎Cnidium officinale Makino.; 桂皮 Cinnamomum cassia Blume.; 桃仁 Prnus persica Batsch.;泽泻 Alisma orientale Juzepczuk.;茯苓Poria cocos i ex Kitamura.; 芍药Paeonia lactiflora Pallas.; 牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.（购于日本药局方）。各药材分别用10倍量水煮提两次，过滤，合并滤液并减压浓缩，真空干燥后配制成1mg/ml的水提液。 　　1.2 试剂 EMDM培养基、无酚红EMDM培养基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培养基、Zymolase试剂（为Sigma公司产品），邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和汉药研究所提供），胎牛血清（FBS，日本和汉药研究所提供），其余试剂均为日本产分析纯。 　　1.3 仪器 电子 读数分析天平(日本 Shimaduz 公司)；二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；台式高速低温离心机(美国Becton Dickinson公司)；全温振荡培养基(美国Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Model 3550-UV紫外分光光度仪(日本SANYO公司)；25 mm2培养瓶、96孔培养板（美国Becton Dickinson）。 　　 2 方法 　　2.1 细胞株及培养条件 雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌细胞由日本和汉药研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培养基培养传代。培养条件：37℃，5%CO2，相对湿度95%。 　　2.2 人血清中甾体激素的去除成年人血清购于Sigma公司,按E-screen法去除其中的甾体激素［4,5］。 　　2.3 细胞增殖实验按E-screen法［5］并稍作修改，普通培养的MCF-7细胞经胰蛋白酶消化后以104个细胞/ml接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，贴壁24h后去除原培养基，换成实验用培养基：无酚红的DMEM基加10%热灭活的无雌激素人血清。继续培养5 d，此时加入阳性（雌二醇）对照组设10-13～10-9mol/L 5个浓度，不同浓度的受试物和阴性（溶剂）对照组，每个浓度设6个复孔。6 d后弃上清液，每孔加5 mg/ml的四唑盐（MTT）30 μl，继续培养4 h。吸去孔中的培养液，每孔加入150 μl的DMSO，在540 nm波长测定吸光度并 计算 增殖率，结果见表1。 　　2.4 酵母菌株和培养基的建立 过夜培养的酵母转种至新的SD液体培养基中，加入不同浓度的植物提取物，于30℃恒温振荡器中培养4h，然后在595 nm测定吸光度。 　　2.5 β