质粒的提取和纯化精要.ppt

质粒的提取和纯化 内 容 一.质粒的概念和提取原理 二.碱裂解法的实验操作和原理 三.煮沸法快速提取质粒的实验操作和原理 四.实验室使用的方法 五.质粒纯化后的检测 一.质粒的概念和提取原理 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活 . 一.质粒的概念和提取原理 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control) 松驰控制型(Relaxed control) 一.质粒的概念和提取原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。