犬细小病毒VP2抗体竞争ELISA检测方法的初步建立.pdfVIP

生物技术 .11 中国畜牧兽医 2012 年第 39 卷第 4 期 犬细小病毒 VP2 抗体竞争 ELISA 检测方法的初步建立 赵丹l.2 ，贾红1 ，侯绍华1 ，袁维峰1 ，郭晓字l ，柏丽华l ，仆仕金z ，朱鸿飞l (1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193;2. 扬州大学，江苏扬州 225009) 摘要:本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovírus. CPV) VP2 抗体，并建立竞争 ELISA 检测方法，从而为 CPV 疫苗免 疫效果的检测及血清学调查提供技术支持.参照 GenBank 中犬细小病毒VP2 基因序列设计1 对添加 EcoR I 和 Xho J 酶切 位点的引物，民:R 扩增 VP2 基因全长序列，将其克隆到 pET28a( 十)载体中，构建原核表达载体 pET28a-VP2.转化大肠杆菌 Rosetta. 表达并纯化了重组蛋白。 SD及 Westem blotting 分析表明，目的蛋白分子质量大小为 67 ku. 可被 CPV 抗血 清识别，证明其能与特异性抗体结合，有良好的抗原性.以纯化的重组蛋白免疫家兔制备 VP2 多抗，采用辣根过氧化物酶进 行标记，初步建立了竞争 ELlSA 方法。结果显示.VPZ 重组蛋白的最佳包被浓度为 5μg/mL. 酶标多抗的最佳稀释度为 1 3200. 封闭条件为 4 c过夜，最适的封闭液为 10%小牛血清，山羊抗兔 IgG-HRP 的最佳工作浓度为 1 I 5000. 显色时间为 25 min，竞争 ELISA 试验结果表明，该方法具有较强的稳定性，有望为 CPV 疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段。 关键词:犬细小病毒;VP2 基因F 表达3 抗体g 竞争 ELISA 文章编号:1671-7236(2012)04-0011-06 中图分类号:S852.4 文献标识码:A 犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvo- 本研究拟对 CPV 的 VP2 基因进行克隆和表 virus ， CPV) 引起的一种高度接触性烈性传染病，该 达，制备多扰，并初步建立了竞争 ELlSA 方法，旨在 病临床上以剧烈呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减 为开发、研制 CPV 免疫学诊断方法奠崽基础。 少为主要特征(孔繁德等， 1995) ，发病率为 50%- 1 材料与方法 100% ，死亡率为 10%-50% ，为对犬危害性最大的 1. 1 材料与试剂 犬细小病毒液由中国农业科学 疾病之一，在世界范围内流行。 院北京畜牧兽医研究所动物医学实验室保存。克隆 犬细小病毒属细小病毒科、细小病毒属、猫细小 用宿主菌 Trans1-Tl 、原核表达质粒 pET28a(+ )及 病毒亚群，病毒粒子元囊膜，呈正二十面体结构z 基因 其表达宿主菌 E. coli Rosetta 均购自北京全式金生 组为单股 DNA，全长约 5 胁，感染犬出现急性、传染 物技术有限公司。 性疾病，表现为胃肠炎症状或心肌炎症状，心肌炎以 LA Taq 酶、 BamH 1 、 Xho 1 内切酶、 T4 幼犬多见(宋桂强等，2007) 。病毒粒子结构蛋白为 DNA 连接酶均购于大连宝生物公司. DNA Mark- VPl ， VP2 和 VP3. 其中 VP2 是主要的结构蛋白(殷 町、PCR 产物纯化/回收试剂盒购自北京全式金生 震等.1997).VP2 中个别关键氨基酸的改变可导致病