第五章原位杂交组织化学.ppt

* Tm值升高说明增加了杂交体的稳定性 间接FISH 地高辛or生物素 Down(21三体)综合征间期细胞中的杂交信号 21－三体综合征 多色FISH 通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法)，在一个细胞核中可呈现多种颜色标记，同时检测多种染色体异常。 Figure 1. Upright optical slice of an intact embryo in blastoderm stage. Double staining for mRNA and protein. Target mRNAs for in situ probes (sog and sna) and protein stained by primary antibody (anti-Dorsal) are indicated in the figure. DAPI was used to label the nuclei. Note that the expression of sog and sna are located apically in the cytoplasm, while the expression of Dorsal is nuclear. 十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型 各染色体标记的探针池组合 FIBER FISH 将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交，最后用荧光显微镜观察结果并分析. 胚胎原位杂交技术 全胚胎原位杂交 从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序, 是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。 胚胎组织切片原位杂交 A：小鼠10.5 dpc胚胎ERβ反义RNA探针的杂交： RE(菱脑), MA(颌弓), PC(心包), SNT(脊神经管), GR(生殖脊), LB(肢芽); B：小鼠10.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交; C: 13.5 dpc胚胎ERb 反义RNA探针的杂交结 果:TE(端脑), ME(中脑), MO(延髓), SC(脊髓), LB(肢芽)： D：小鼠13.5 dpc胚胎ERb 有意义链RNA探针的杂交。 原位杂交结合免疫组织化学 电镜原位杂交 肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)原位杂交 肽核酸是一类人工合成的电中性的肽链, 以多聚酰胺键形成的类似核苷酸的物质。 具有一个拟肽骨架，没有磷酸戊糖骨架. PNA链更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合. PNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低. PNA不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解。 LNA(Locked?Nucleic?Acid) 是一种核酸类似物，和普通核酸分子区别在于在其碳环的2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸。 探针中每融合一个LNA能够使Tm值升高2-10度  LNA的优势增强热稳定性、杂交的特异性、提高探针TM值、增加亲和性 LNA的应用LNA技术目前已经广泛应用于分子生物学各个领域，如：芯片、原位杂交等等 A long way to go!! M-FISH and CGH Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization (M-FISH) and Comparative Genomic Hybridization (CGH) are complementary fluorescent molecular cytogenetic techniques. M-FISH?acquires images of each human or mouse chromosome in a different color,?allowing semi-automatic?karytyping and?the identification of chromosomal aberrations.  The complimentary technique of CGH?visualises the hybridization of differentially labeled reference DNA sequences?to generate a high resolution map of DNA copy number changes?in the?genome. We can further?investigate copy number variation using?the Aff