肿瘤细胞培养基本方法.doc.doc

肿瘤细胞培养基本方法 (一)准备和安装过滤器?清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。?(二)合成培养基的配制1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。? 培养基 品牌 货号 D-MEM/F-12 GIBCO Dulbeccos Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) GIBCO F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder GIBCO Iscoves Modified Dulbeccos Medium (IMDM) powder GIBCO Leibovitzs L-15 Medium powder GIBCO McCOYs 5A SIGMA M4892 Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα)with ribonucleosides and deoxyribonucleosides GIBCO Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα)without ribonucleosides and deoxyribonucleosides GIBCO Minimum Essential Medium (MEM) powder GIBCO NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHNSMODIFICATION (F12K) SIGMA N3520 RPMI Medium 1640 GIBCO EGF SIGMA E9644 Sodium pyruvate SIGMA P2256-25G MEDIUM 199, WITH EARLES SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED SIGMA M5017 2、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。3、 调 pH至7.2左右。4、 加水至最终体积。5、 在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。6、 瓶口封好，4℃冰箱贮存。?(三)小牛血清的处理?市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。1、 将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。2、 处理后的血清贮存于4℃。3、 小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。?(四)生长培养基的配制?除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 按如下比例配制： 基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。 (五)冻存细胞的复苏 应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。 在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。 (六)传代: 贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。 悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内